Le gène avrA est la cible d'insertions génétiques

La comparaison de la séquence du gène avrA de trois souches de R.

solanacearum avec celle de avrAGMI1000 a révélé la présence de VNTR dans ces trois

souches. Ces répétitions en tandem, de 12 paires de base chacune, débutent au codon 52 des gènes avrA des souches AW1, UW551 et Molk2 ; ce codon correspond au codon 45 de avrAGMI1000. Le nombre de répétions en tandem varie selon la souche ; il y en a 6 dans avrAAW1, 10 dans avrAUW551 et 15 dans avrAMolk2, ces deux dernières souches étant phylogénétiquement très proches. Ce nombre est corrélé avec les effets de ces souches sur N. tabacum. En effet, les souches ayant le moins de VNTR

Résultats. Chapitre 1

à savoir GMI1000 (aucun VNTR) et AW1 élicitent une HR et ne sont pas pathogènes tandis que UW551 et Molk2 provoquent la maladie. Nous avons d'autre part montré que la région de avrAGMI1000 comprise entre les codons 32 et 50 est impliquée dans l'élicitation de la HR. Il est donc possible que l'insertion des VNTR soit un moyen de masquer un domaine d'AvrA impliqué dans la reconnaissance de cet ET3 par le système immunitaire végétal.

Quel est le rôle des VNTR ?

Afin de mieux comprendre le rôle de ces VNTR, nous pourrions consolider la corrélation entre le nombre de répétitions et l'élicitation de la HR. Pour cela, il est envisageable de séquencer le gène avrA d'un grand nombre de souches et d'étudier le comportement de ces souches sur tabac.

D'autre part, nous avons également fait exprimer de manière transitoire le gène avrAMolk2 chez le tabac ; de manière inattendue, AvrA Molk2 provoque une

nécrose de type HR sur les plantes du genre Nicotiana (Figure 26). Cela peut

paraître contradictoire avec le fait que la souche Molk2 elle-même n'élicite pas de HR. On ne peut exclure que cette souche possède parmi son répertoire d'effecteurs un ET3 capable de supprimer la HR induite par AvrA ; cet ET3 serait absent de la souche GMI1000. Cependant, il est également possible que la HR observée lors des expériences d'expression transitoire soit due à une forte expression qui diminue la spécificité de reconnaissance entre AvrA et la protéine R correspondante. En effet, on peut penser que le tabac possède une protéine R capable de reconnaître efficacement et spécifiquement AvrAGMI1000 mais incapable de reconnaître AvrAMolk2

dans des conditions naturelles d'infection. Cette différence de reconnaissance pourrait être due à la présence de VNTR dans AvrAMolk2. Lorsque AvrAMolk2 est

présent en fortes quantités dans les cellules de tabac, il est possible que la spécificité de reconnaissance diminue ce qui suffit à induire une HR. Un tel phénomène a déjà été observé chez X. campestris. En effet, la protéine de résistance Bs4 reconnaît spécifiquement l'effecteur AvrBs4 ; elle n'induit pas de réponses de défense en présence de AvrBs3 bien que celui-ci partage 96,6% d'identité avec AvrBs4 (Ballvora

et al., 2001; Pierre et al., 2000; Schornack et al., 2006). Cependant, l'expression

constitutive in planta de avrBs3 sous contrôle d'un promoteur fort élicite une HR dépendante de Bs4 (Schornack et al., 2004). Pour éclaircir l'interprétation de nos données, nous pourrions remplacer dans la souche GMI1000 le gène avrAGMI1000 par

AvrA

AvrA

Figure 26. L’expression transitoire de AvrA_Molk2élicite une HR

L’infiltration de la souche d’A. tumefaciens contenant pMP100 (AvrA_Molk2) conduit à l‘apparition d’une nécrose de type HR sur N. tabacum et N.

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le gène avrAMolk2 afin de s'affranchir de l'artéfact pouvant être causé par la surexpression. D'autre part, afin de tester le rôle des VNTR, nous pourrions construire un mutant avrA de R. solanacearum GMI1000 en y introduisant des VNTR ou, à l'inverse, un mutant avrA de la souche Molk2 en y délétant les VNTR. Si les VNTR conditionnent la spécificité de reconnaissance chez le tabac, alors le mutant de GMI1000 devrait être affecté dans sa capacité à éliciter la HR et le mutant de Molk2 devrait acquérir la capacité à éliciter la HR.

En conclusion, l'insertion des VNTR se produit dans une région impliquée dans l'élicitation de la HR ; cela suggère que ces VNTR modulent la fonction d'avirulence d'avrA bien que cela reste à démontrer. Il est intéressant de noter que le gène avrA n'est pas le seul gène codant pour un ET3 à être la cible de VNTR dans le génome de R. solanacearum.

Présence de VNTR dans deux gènes codant pour des ET3 de la souche GMI1000 Les VNTR sont présents dans les gènes RSp1218 et RSp0215 de la souche GMI1000. RSp1218 code pour un ET3 de fonction inconnue possédant un domaine de répétitions "ankyrine" connu pour être impliqué dans des interactions de type protéine-protéine. L'insertion des VNTR se produit dans la région promotrice de ce gène entre la boîte hrpII et le codon d'initiation de la traduction (Figure 27A). Les répétitions de 9 paires de bases chacune sont au nombre de 15. Ces VNTR sont absents dans les gènes homologues des souches Molk2 (RSMK03290) et IPO1609 (RSIPO4247). Leur insertion dans le gène RSp1218 de GMI1000 résulte en une augmentation de 105 paires de base de la distance entre la boîte hrpII et le codon d'initiation de la traduction. Ils modulent donc peut-être le niveau de transcription ou la stabilité de l'ARN messager. D'autre part, dans la souche GMI1000, le gène

RSp1218 est la cible d'une IS qui interrompt la phase ouverte de lecture. Selon les

prédictions bioinformatiques, la protéine produite par GMI1000 aurait une taille de 165 acides aminés alors que celles produites par les souches Molk2 et IPO1609 contiendraient respectivement 793 et 791 acides aminés. Le gène RSp1218 est donc, comme avrA, la cible d'insertion d'ADN et d'éléments mobiles.

Un autre gène, RSp0215 codant pour un ET3 de la famille HLK (HLK2) possède des VNTR. Il s'agit ici de répétitions de 9 paires de base dans la phase codante qui ne décalent donc pas le cadre de lecture (Figure 27B). Ils sont absents

boîte hrp_II -10 Init. trad. Molk2 IPO1609 GMI1000 Molk2 IPO1609 GMI1000 Molk2 IPO1609 GMI1000 Molk2 IPO1609 TCCACCGCG TCCATTGCG TCCATTGTG 3 types de répétitions : GMI1000 Molk2 IPO1609 GMI1000 Molk2 IPO1609 A D A T D A T D A T E A T E A T E A T E A T E A T V R T E D A D A V D A A D T A D W T E D S T L S E P D R S F A A E P GCGGATGCA ACTGATGCA ACTGATGCG ACCGAAGCG ACGGTCCGG ACCGAGGAC 6 types de répétitions :

B.

Figure 27. Structure des VNTR dans les gènes RSp1218 (A) et RSp0215 (B)

A. Chaque type de répétition est encadré d’une certaine couleur. Les 3 types de répétitions sont alignés et les nucléotides conservés sont en rouge. "Init. trad." désigne le codon d’initiation de la traduction.

B. Le type de répétition le plus fréquent est encadré en vert ; les autres types sont uniques et encadrés en noir. La séquence protéique codée par les VNTR est

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dans les gènes homologues de Molk2 (RSMK04916) et IPO1609 (RSIPO04317) ; dans la souche GMI1000, l’insertion des VNTR se substitue à une région codante présente dans les gènes des autres souches. Les VNTR présents dans le gène

RSp0215 de la souche GMI1000 modifient donc une partie de la séquence

protéique, ce qui influe potentiellement sur la fonction (encore inconnue) de cet ET3.

Les gènes codant pour les ET3 peuvent donc être la cible d'insertions de VNTR. Cela doit permettre à R. solanacearum de faire évoluer ses ET3 pour acquérir de nouvelles fonctions de virulence ou, comme on le suppose dans le cas d'avrA, pour échapper à la reconnaissance R/Avr. Un moyen plus simple

d'empêcher cette reconnaissance serait de perdre le gène ou d'y introduire une mutation perte de fonction. L’intérêt de l'insertion de VNTR est de permettre potentiellement une réversion rapide. Une autre particularité des VNTR est de conserver la phase de lecture et donc de ne vraisemblablement pas induire une perte de fonction totale dans le cas d’une protéine possédant des domaines fonctionnels distincts. Ainsi la partie de la protéine AvrA en aval des VNTR reste inchangée. Cela suggère donc qu'en plus de la fonction modifiée par les VNTR, le gène avrA possède au moins une autre fonction importante pour la bactérie, probablement une fonction de virulence. Cette hypothèse est soutenue par une étude récente qui montre que AvrA est un ET3 important dans les phases précoces de l'infection (Turner et al., 2009).