III. 5. 3. 1. Le vieillissement
Le! vieillissement! s’accompagne! d’une! altération! globale! d’un! ensemble! de! fonctions! physiologiques!et!d’une!susceptibilité!plus!élevée!de!développer!différentes!maladies!(Bossy=Wetzel! et!al.!2003;!Liochev!2013;!Mattson!and!Magnus!2006;!Venditti!et!al.!2013;!Venkataraman!et!al.!2013).! La! théorie! radicalaire! explique! ces! altérations! par! l’accumulation! de! molécules! oxydées! et! leurs! conséquences!comme!l’apparition!de!mutations!dans!l’ADN!mitochondrial!et!nucléaire,!ainsi!que!par! la! carbonylation! des! protéines,! leur! dénaturation! et! leur! agrégation,! aux! côtés! de! l’oxydation! des! lipides.! Il! y! aurait! une! corrélation! inverse! entre! la! durée! de! vie! et! les! dommages! oxydatifs.! Cette! théorie!a!été!formulée!pour!la!première!fois!par!Harman,!en!1956,!avant!même!que!la!pertinence! biologique! des! radicaux! libres! ait! été! démontrée! (Harman! 1956).! Plusieurs! arguments! mettent! en! avant! l’implication! des! radicaux! libres! dans! les! mécanismes! du! vieillissement.! Une! élévation! des! marqueurs!biologiques!du!stress!oxydant!comme!la!8=oxo=guanine,!le!dialdéhyde!malonique!(MDA)! et!les!isoprostanes!a!été!observée!au!cours!du!vieillissement!de!nombreuses!espèces!(Lane!2003).! Par! ailleurs,! des! études! récentes! de! la! variation! du! transcriptome! au! cours! du! vieillissement,! y! compris!chez!le!singe,!ont!révélé!l’induction!de!plusieurs!gènes!codant!des!enzymes!antioxydantes!et! la!répression!de!gènes!de!la!chaîne!respiratoire,!révélatrices!d’une!adaptation!au!cours!du!temps!à! un! état! cellulaire! pro=oxydant! (Kayo! et! al.! 2001).! Enfin,! l’efficacité! des! mécanismes! de! réparation! cellulaire! comme! le! protéasome,! les! protéines! chaperones,! plusieurs! enzymes! réductrices! et! les! systèmes!de!réparation!de!l’ADN!diminue!avec!l’âge,!ce!qui!contribue!à!l’accumulation!d’anomalies! dans!la!cellule!(Kirkwood!and!Shanley!2005;!Kirkwood!2005;!Sohal!and!Orr!2012;!Sohal!2002a,!Sohal! 2002b).! Les! cellules! se! comportent! comme! si! elles! avaient! un! «! capital! anti=stress! »! dont! l’épuisement! conduit! au! vieillissement.! Ainsi,! toute! condition! environnementale! ou! génétique!
tendant!vers!l’augmentation!des!agressions!cellulaires!(oxydantes!ou!non)!ou!vers!des!diminutions! des!capacités!de!défenses!ou!de!réparation,!devrait!se!traduire!par!un!vieillissement!accéléré.!!
III. 5. 3. 2. Le vieillissement cellulaire ou sénescence
Au! niveau! cellulaire,! le! vieillissement! est! dénommé! sénescence,! un! état! irréversible! dans! lequel! les! cellules! endommagées! ne! prolifèrent! plus,! mais! demeurent! métaboliquement! actives! (Ben=Porath! and! Weinberg! 2005;! Bischof! et! al.! 2009).! La! sénescence! est! un! processus! moléculaire! complexe! activé! par! différents! stimuli.! Dans! les! conditions! physiologiques,! les! mitoses! successives! induisent!la!sénescence!dite!réplicative.!Elle!est!provoquée!par!le!raccourcissement!des!télomères,! inhérent!à!la!division!cellulaire!et!reconnu!comme!un!dommage!à!l’ADN.!Ce!raccourcissement!active! les! protéines! inhibitrices! du! cycle! cellulaire! comme! p21cip1/waf1,! p53,! p16! et! Rb! (protéine! du! rétinoblastome)!et!mène!finalement!à!la!sénescence!par!épuisement!du!potentiel!réplicatif!(Brown! et!al.!1997;!Takai!et!al.!2003).!Toutefois,!la!sénescence!peut!aussi!être!déclenchée!indépendamment! de! la! longueur! des! télomères,! en! présence! de! diverses! sources! de! stress! comme! des! oncogènes,! rayons!UV!ou!le!stress!oxydant.!On!parle!alors!de!sénescence!induite!prématurément!par!le!stress! (SIPS).!Elle!passe!par!la!cavéoline=1,!la!voie!de!ERK1/2!(extracellular!signal!regulated!kinases!1!and!2)! et! celle! de! p38! MAPK! (mitogen! activated! protein! kinase)! qui! activent! également! les! protéines! inhibitrices!du!cycle!cellulaire!(Ben=Porath!and!Weinberg!2005;!Bischof!et!al.!2009).!
III. 5. 3. 3. Sénescence, EAO et mitochondries
! L’origine! de! l’accumulation! d’EAO! dans! la! cellule! induite! lors! du! vieillissement! est! principalement!mitochondriale!(Sastre!et!al.!2003;!Viña!et!al.!2003).!En!effet,!la!mitochondrie!est!non! seulement! une! des! principales! sources! d’EAO! intracellulaires,! mais! aussi! la! cible! directe! de! leurs! conséquences!délétères.!Les!fonctions,!la!morphologie!et!le!renouvellement!des!mitochondries!sont! altérés!au!cours!du!vieillissement,!notamment!en!raison!de!l’accumulation!de!mutations!somatiques! de!l’ADN!mitochondrial,!une!cible!privilégiée!des!EAO!produites!par!la!chaîne!respiratoire.!Comme! exemple,! le! nématode! C.& Elegans! muté! pour! mev=1,! déficient! pour! le! complexe! II! de! la! chaîne! respiratoire,!présente!des!dommages!oxydatifs!et!une!diminution!de!30!!%!de!sa!durée!de!vie.!Ces! vers! subissent! donc! un! vieillissement! accéléré! et! le! traitement! par! des! composés! mimétiques! des! activités! SOD! ou! catalase! (EUK=8! et! EUK=134)! restaure! une! durée! de! vie! égale! à! celle! des! vers! sauvages!(Melov!2000;!Melov!et!al.!2000),!démontrant!un!fois!de!plus!le!rôle!fondamental!des!EAO! mitochondriales!dans!le!processus!du!vieillissement.!Chez!l’homme,!l’augmentation!des!dommages! oxydatifs!au!cours!de!l’hyperglycémie!et!du!vieillissement,!mais!aussi!au!cours!de!certaines!maladies! mitochondriales!(syndromes!MELAS![Mitochondrial!Encephalomyopathy,!Lactic!Acidosis!and!Stroke!
like! episodes]! et! MERRF! [Myoclonic! Epilepsy! and! Ragged! Red! Fibres])! ou! neurodégénératives! (Parkinson,! Alzheimer),! pourrait! être! liée! à! une! surproduction! d’EAO! mitochondriales! non! compensées.!
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Problématique
! !PROBLEMATIQUE
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L’Atrophie! Optique! Dominante! de! type! 1! (ADOA=1)! est,! avec! la! neuropathie! optique! héréditaire!de!Leber!(LHON),!la!forme!majoritaire!d’atrophie!optique!héréditaire.!Cette!rétinopathie! est! caractérisée! par! une! dégénérescence! des! cellules! ganglionnaires! de! la! rétine! se! traduisant! par!! une! atrophie! du! nerf! optique! et! pouvant! conduire! dans! certains! cas! à! la! cécité.! Des! mutations! du! gène!codant!la!protéine!mitochondriale!OPA1!sont!responsables!de!la!mise!en!place!de!la!pathologie! de! l’ADOA=1.! Afin! de! mieux! comprendre! les! mécanismes! physiopathologiques! responsables! de! la! pathogenèse!de!l’ADOA=1,!l’équipe!s’est!intéressée!dans!un!premier!temps!aux!effets!de!la!perte!de! fonction! d’OPA1! in& vitro.! La! diminution! de! la! protéine! OPA1! (par! stratégie! d’interférence! à! l’ARN)! dans! des! cellules! HeLa! et! des! cellules! NIH=OVCAR=3,! induit! notamment! une! sensibilité! accrue! des! cellules!à!l'apoptose!(Olichon!et!al.!2007).!De!même,!cette!sensibilité!aux!stimuli!pro=apoptotiques!a! été! retrouvée! dans! des! fibroblastes! de! patients! atteints! d’ADOA=1! et! dans! des! cellules! HeLa! exprimant!différentes!formes!pathogènes!du!gène!OPA1,!et!ce!quels!que!soient!la!mutation!et!les! mécanismes!engendrés!(haploinsuffisance!ou!«!dominance!négativité!»)!(Olichon!et!al.!2003).!Ainsi,! les! neurones! ganglionnaires! de! rétine! de! patients! atteints! d'ADOA=1! pourraient! dégénérer! par! apoptose,!comme!cela!a!été!proposé!pour!la!neuropathie!optique!de!Leber!(Carelli!et!al.!2004).!!
L’ADOA=1!présente!une!pénétrance!incomplète!et!une!variation!des!atteintes!inter=!et!intra= familiales! qui! la! placent! dans! les! maladies! monogéniques! à! caractère! multifactoriel! (Lenaers! et! al.! 2012).! Environ! 20! %! des! patients! présentent! une! forme! syndromique! de! la! maladie! avec! des! atteintes! neuronales! extra=oculaires! comme! une! surdité,! une! ataxie! et/ou! une! myopathie! (Amati= Bonneau!et!al.!2008;!Hudson!et!al.!2008).!De!nombreuses!études!se!sont!focalisées!sur!le!rôle!de!la! protéine!dans!la!fusion!des!membranes!internes!mitochondriales!ou!dans!son!rôle!anti=apoptotique! par!la!séquestration!du!cytochrome!c!dans!l’espace!intra=crête!(Olichon!et!al.!2006).!Une!autre!piste! a!été!explorée!à!partir!de!modèles!invertébrés!de!l’ADOA=1!(Drosophile!ou!C.&Elegans),!de!cellules! invalidées! pour! OPA1! ou! de! tissus! de! patients,! supposant! l’implication! de! la! dynamine! dans! le! métabolisme! énergétique! mitochondrial! (Kanazawa! et! al.! 2008;! Tang! et! al.! 2009).! Néanmoins,! certains! des! résultats! obtenus! restent! controversés! et! les! mécanismes! moléculaires! sont! mal! identifiés.!!
Afin! de! préciser! les! mécanismes! moléculaires! impliqués! dans! l’étiologie! de! la! maladie! de! l’ADOA=1,!nous!avons!donc!choisi!de!déterminer!l’interactome!d’OPA1!à!partir!de!neurones!corticaux! pour!préciser!les!partenaires!clés!de!la!dynamine.!Nous!avons!dans!ce!contexte!identifié!un!acteur!
central!du!métabolisme!oxydatif!mitochondrial.!Ainsi,!une!partie!importante!de!mon!projet!de!thèse! s’est! inscrite! dans! un! objectif! global! visant! à! caractériser! l’homéostasie! redox! des! cellules,! consécutivement! à! la! perte! de! fonction! de! la! dynamine! mitochondriale! OPA1.! Nous! avons! principalement! travaillé! sur! différents! modèles! cellulaires! de! l’ADOA=1,! tels! que! la! lignée! cellulaire! HeLa!et!des!neurones!corticaux!de!rats!en!culture!primaire,!invalidés!pour!OPA1!par!une!stratégie! d’interférence!à!l’ARN,!et!des!fibroblastes!de!peau!de!patients.!Certaines!questions!ont!également!pu! être!posées!dans!un!modèle!murin!de!la!pathologie.!Nous!avons!donc!exploré!plus!précisément!les! répercussions!de!la!perte!de!fonction!de!la!dynamine!sur!le!métabolisme!oxydatif!mitochondrial,!sur! l’état! des! défenses! antioxydantes! et! sur! les! mécanismes! intracellulaires! impliqués! lors! d’un! stress! oxydatif.!!