Bien!que!la!pathologie!de!l’ADOA=1!soit!décrite!comme!neurodégénérative,!nous!avons!fait!le! choix!de!travailler!également!dans!des!cellules!HeLa!et!de!présenter!les!résultats!au!même!titre!que! les! neurones! en! culture! primaire.! En! effet,! nous! avons! pu! démontrer! que! la! mécanistique! intracellulaire! impliquée! en! réponse! à! la! diminution! d’OPA1! est! «!pluri=tissulaire!»! car! elle! ne!
s’applique! pas! uniquement! à! des! cellules! neuronales,! ce! qui! permet! d’intégrer! ce! travail! dans! un! contexte!physiologique!et!physiopathologique!plus!global.!
Le! métabolisme! oxydatif! mitochondrial! est! altéré! dans! des! cellules! dont! la! quantité! d’OPA1! est! diminuée!
Comme! précédemment,! afin! de! mimer! une! haploinsuffisance! du! gène! OPA1,! nous! avons! diminué! la! quantité! de! la! protéine! par! une! stratégie! d’interférence! à! l’ARN! dans! des! cellules! humaines! (HeLa)! et! des! neurones! corticaux! en! culture! primaire! (rat).! Nous! avons! montré! que! la! diminution! de! la! quantité! d’OPA1! dans! les! cellules! HeLa! (Olichon! et! al.! 2007)! et! des! neurones! (Bertholet! et! al.! 2013)! provoque! une! baisse! du! potentiel! de! membrane! mitochondrial.! Ce! phénomène!est!d’ailleurs!retrouvé!dans!MEFs!invalidés!pour!OPA1!par!interférence!à!l’ARN!(Chen!et! al.! 2005b).! Cette! diminution! traduirait! une! perturbation! de! l’activité! de! la! chaîne! respiratoire! mitochondriale.! En! effet,! nous! avons! montré! que! la! respiration! spontanée! est! significativement! diminuée!dans!les!cellules!HeLa!et!les!neurones!dont!l’expression!d’OPA1!est!diminuée.!Ces!résultats! corrèlent! avec! les! données! obtenues! dans! des! MEFs! déplétés! pour! OPA1! (Chen! et! al.! 2005b),! des! fibroblastes!ou!des!muscles!issus!de!patients!atteints!d’ADOA=1!(Amati=Bonneau!et!al.!2005;!Chen!et! al.! 2005;! Chevrollier! et! al.! 2008;! Cipolat! et! al.! 2004;! Lodi! et! al.! 2004;! Song! et! al.! 2007;! Song! et! al.! 2009;! Zanna! et! al.! 2008),! chez! le! poisson! zèbre! invalidé! pour! OPA1! (Rahn! et! al.! 2013)! et! chez! la! drosophile!dOPA1+/Z!(Tang!et!al.!2009).!De!manière!surprenante,!l’ajout!de!l’agent!découplant!FCCP!
n’augmente! pas! plus! la! respiration! cellulaire,! contrairement! au! poisson! zèbre! invalidé! pour! OPA1! (Rahn! et! al.! 2013).! Ainsi,! dans! nos! modèles! cellulaires! d’ADOA=1,! la! respiration! spontanée! serait! maximale.! Ce! phénomène! a! déjà! été! décrit! dans! des! modèles! cellulaires! ou! animaux! de! maladies! neurodégénératives! comme! la! souris! TG2576! modèle! de! la! maladie! d’Alzheimer! (Varghese! et! al.! 2011)!ou!dans!des!cellules!striatales!modèles!de!la!maladie!de!Huntington!(STHdhQ111)!(Siddiqui!et! al.! 2012).! De! manière! intéressante,! dans! des! cellules! dopaminergiques! N27! en! culture,! l’ajout! de! paraquat! (molécule! qui! induit! un! stress! oxydatif! en! inhibant! le! complexe! I)! ne! perturbe! pas! la! respiration!spontanée!des!cellules!mais!altère!la!capacité!respiratoire!maximale!des!mitochondries! (Lopert! et! al.! 2012).! Dans! ce! modèle,! l’inhibition! du! système! antioxydant! thioredoxine/peroxiredoxine!cumulée!avec!le!traitement!par!le!paraquat!induit!une!diminution!des! différents! stades! respiratoires! (spontané! et! maximal),! tout! comme! dans! nos! modèles! cellulaires! invalidés!pour!OPA1.!Ainsi,!perturber!l’état!redox!intracellulaire!induit!les!mêmes!conséquences!sur! l’activité!mitochondriale!que!la!perte!d’OPA1.!!
A! la! lumière! de! mes! travaux! de! thèse! et! des! données! bibliographiques,! deux! questions! se! posent! alors!:! i)! par! quels! mécanismes! la! diminution! d’OPA1! induit=elle! une! perturbation! de! la!
respiration!mitochondriale!spontanée!?!ii)!pourquoi!la!respiration!n’est=elle!pas!stimulée!par!l’ajout! d’un!agent!découplant!dans!des!cellules!déplétées!pour!OPA1!?!!
Nous! avons! montré! que! les! neurones! (Bertholet! et! al.! 2013)! et! les! cellules! HeLa,! invalidés! pour!OPA1,!présentent!une!diminution!de!la!quantité!de!certaines!sous=unités!représentatives!des! complexes!de!la!chaîne!respiratoire.!Les!complexes!I,!II,!III!et!IV!sont!affectés,!alors!que!la!quantité!du! complexe!V!reste!inchangée.!De!plus,!des!intéractions!d’OPA1!avec!les!complexes!respiratoires!I,!II!et! III,!ont!été!retrouvés!par!co=immunoprécipitations!dans!des!fibroblastes!humains!(Zanna!et!al.!2008).! Nous!pouvons!donc!proposer!la!dissociation!des!macro=complexes!«!OPA1=complexes!respiratoires!»,! lors!du!traitement!des!cellules!par!siOPA1,!responsable!de!la!déstabilisation!des!sous=unités!et!donc! de!l’intégrité!des!complexes.!Des!effets!«!indirects!»!de!la!perte!d’OPA1!sont!également!envisagés! étant! donné! son! rôle! dans! le! maintien! de! l’ADNmt.! En! effet,! comme! il! a! déjà! été! décrit! dans! des! cellules!HeLa!(Elachouri!et!al.!2010)!et!des!MEFs!KO!pour!OPA1!(Chen!et!al.!2007;!Chen!et!al.!2010),! nos!analyses!montrent!que!le!nombre!de!nucléoïdes!est!également!altéré!par!la!perte!d’OPA1!dans! les!neurones!cultivés!ex&vivo&(Bertholet!et!al.!2013).!Ces!résultats!corrèlent!avec!les!travaux!menés! dans!des!lymphocytes!de!patients!qui!montrent!une!diminution!du!nombre!de!copies!d’ADNmt!(Kim! et!al.!2005).!Des!délétions!d’ADNmt!ont!également!été!observées!dans!des!cellules!musculaires!de! patients! atteints! du! syndrome! «!ADOA=1! plus!»! (Amati=Bonneau! et! al.! 2008!;! Hudson! et! al.! 2008).! Etant! donné! que! le! génome! mitochondrial! code! 13! sous=unités! de! la! chaîne! respiratoire,! la! diminution!de!la!respiration!mesurée!consécutivement!à!la!perte!d’OPA1!pourrait!être!le!reflet!de!la! diminution! d’ADNmt.! De! plus,! la! sous=unité! COXI,! codée! par! le! génome! mitochondrial,! diminue! drastiquement!dans!nos!modèles.!
La! diminution! de! la! quantité! de! certains! complexes! respiratoires! pourrait! entraîner! une! baisse! de! leur! activité! (Chen! et! al.! 2005;! Tang! et! al.! 2009)! et! donc! expliquer! la! diminution! de! la! respiration!cellulaire.!Or,!excepté!le!complexe!II!qui!diminue!d’environ!25!%,!l’activité!des!complexes!
in&vitro&reste!stable!dans!nos!conditions.!La!diminution!de!la!respiration!mitochondriale!n’est!donc!
pas! le! reflet! d’un! défaut! d’activité! intrinsèque! des! complexes.! Ainsi,! nous! proposons! une! autre! hypothèse!:! l’organisation! des! complexes! respiratoires! en! supercomplexes.! En! effet,! ces! «!respirasomes!»! sont! essentiels! pour! l’assemblage! et! la! stabilité! des! complexes! (Acin=Perez! et! al.! 2004;!Diaz!et!al.!2006;!Li!et!al.!2007)!et!semblent!impliqués!dans!l’efficacité!du!transfert!d’électrons! (Acin=Perez! et! al.! 2014;! Vartak! et! al.! 2013).! Les! complexes! respiratoires! et! les! respirasomes! sont! notamment! concentrés! au! niveau! des! crêtes! mitochondriales! car! l’essentiel! du! cytochrome! c,! le! transporteur! d’électrons! du! complexe! III! au! IV,! s’accumule! dans! l’espace! intra=crête! (Vogel! et! al.! 2006).! Sachant! que! la! protéine! OPA1! a! un! rôle! prépondérant! dans! la! structuration! des! crêtes! mitochondriales,! la! perte! de! fonction! de! cette! dynamine! perturbe! l’organisation! de! la! membrane!
interne! (Cipolat! et! al.! 2006;! Darshi! et! al.! 2010;! Frezza! et! al.! 2006).! Ainsi,! la! diminution! de! la! respiration!observée!dans!nos!conditions!peut!être!expliquée!par!la!désorganisation!des!crêtes!qui! engendre!par!voie!de!conséquence!une!dissociation!des!supercomplexes!en!forme!libre!(Lenaz!and! Genova,! 2009).! Un! article! paru! très! récemment! met! en! avant! l’importance! de! la! forme! des! crêtes! pour!l’assemblage!et!la!stabilité!des!supercomplexes!et!l’efficacité!de!la!respiration!in&vitro&et!in&vivo& (Cogliati! et! al.! 2013).! Les! auteurs! démontrent! que! la! perte! d’OPA1! induite! dans! une! lignée! immortalisée!de!fibroblastes!issus!de!souris!adultes!(MAFs),!engendre!des!défauts!de!mise!en!place! des! supercomplexes.! Résultats! que! les! auteurs! ont! également! retrouvés! dans! des! MEFs! KO! pour! OPA1!et!in&vivo!dans!des!mitochondries!de!foie!de!souris!invalidées!de!manière!inductible!pour!OPA1.! De! plus,! une! surexpression! de! la! protéine! OPA1! d’environ! 50! %! induit! des! crêtes! serrées! et! une! augmentation!du!nombre!de!supercomplexes!dans!des!mitochondries!de!foie!de!souris!(Cogliati!et!al.! 2013).! Enfin,! l’ajout! d’un! agent! découplant! ne! stimule! pas! la! respiration! spontanée! des! cellules! déplétées!pour!OPA1.!Nous!pouvons!supposer!que!la!respiration!mesurée!à!l’état!spontanée!est!déjà! à!son!maximum,!ce!qui!implique!que!le!découplage!de!la!phosphorylation!oxydative!n’ait!aucun!effet! sur!la!consommation!en!oxygène.!Pour!expliquer!l’origine!de!la!diminution!de!la!respiration!cellulaire! dans! nos! modèles,! nous! envisageons! donc! de! vérifier! la! nature! et! la! stabilité! des! supercomplexes! dans!nos!modèles!cellulaires,!invalidés!pour!OPA1!par!interférence!à!l’ARN,!avec!la!technique!du!Blue! Native! Polyacrylamide! Gel! Electrophoresis! (BN=PAGE)! (Leary! 2012).! Un! autre! travail! publié! très! récemment! met! en! lumière! le! lien! très! étroit! entre! OPA1,! la! fusion! mitochondriale! et! la! phosphorylation! oxydative! (OXPHOS)! à! l’aide! d’un! outil! permettant! la! visualisation! des! différents! compartiments!mitochondriaux!par!microscopie!à!fluorescence,!in&vitro!(Mishra!et!al.!2014).!En!effet,! stimuler!la!respiration!mitochondriale,!comme!par!exemple!en!présence!d’un!milieu!galactose,!induit! une! augmentation! de! la! fusion! des! membranes! internes! mitochondriale,! suite! au! clivage! de! la! dynamine! OPA1! par! la! protéase! YME1L.! Le! lien! entre! la! fusion! mitochondriale! et! le! métabolisme! énergétique!serait!établi!par!la!dynamique!des!formes!longues!et!courtes!d’OPA1!(Mishra!et!al.!2014).! Cet!outil!ouvre!de!nouvelles!perspectives!de!compréhension!du!lien!entre!OPA1!et!le!métabolisme! oxydatif! et! pourrait! être! utilisé! dans! des! tissus! de! patients! porteurs! de! mutations! du! gène! OPA1,! notamment!celles!responsables!d’un!effet!dominant!négatif!comme!la!forme!G300E!(Landes!et!al.! 2010).!! Comme!nous!pouvons!le!constater,!la!perte!de!la!dynamine!OPA1!engendre!une!diminution! de!la!respiration,!de!la!quantité!de!certains!complexes!et!du!nombre!de!nucléoïdes.!Cependant,!la! biomasse!mitochondriale!est!stable!dans!les!cellules!HeLa!et!les!neurones!traités!par!siOPA1,!ce!qui! signifie!que!les!conséquences!de!l’invalidation!de!la!dynamine!ne!sont!pas!liées!à!des!perturbations! de!la!biomasse!mitochondriale.!
Le! défaut! de! la! phosphorylation! oxydative! des! mitochondries! de! cellules! invalidées! pour! OPA1!pourrait!s’accompagner!d’un!déficit!de!synthèse!d’ATP!mitochondrial.!Dans!nos!conditions,!les! taux!d’ATP!intracellulaires!dans!les!cellules!HeLa!et!les!neurones!sont!stables.!Ces!résultats!sont!en! accord! avec! les! dosages! d’ATP! effectués! à! partir! de! fibroblastes! ou! de! muscles! issus! de! patients! atteints!d’ADOA=1!(Spinazzi!et!al.&2008;!Chevrollier!et!al.!2008).!Néanmoins,!dans!les!mêmes!tissus! analysés,!d’autres!études!montrent!une!diminution!du!taux!d’ATP!(Lodi!et!al.!2004;!Agier!et!al.!2012).! Plusieurs!hypothèses!peuvent!être!formulées!:!1)!la!quantité!du!complexe!V!n’est!pas!affectée!par!la! perte! d’OPA1! dans! nos! modèles,! l’activité! resterait! donc! stable,! 2)! l’ATP! serait! produit! principalement!par!la!glycolyse.!Les!cellules!cultivées!sont!en!présence!d’un!milieu!contenant!4,5!g/L! de!glucose.!Cette!«!hyperglycémie!»!favorise!la!production!d’ATP!par!la!glycolyse!ce!qui!implique!que! nous! ne! sommes! pas! dans! les! meilleures! conditions! pour! analyser! l’activité! de! l’ATP! synthase! mitochondriale.! Toutefois,! en! conservant! nos! conditions! de! culture,! nous! pourrions! déterminer! la! part!de!la!mitochondrie!dans!la!production!totale!d’ATP!en!utilisant!l’oligomycine,!un!inhibiteur!du! complexe! V,! ou! une! technique! de! FRET! avec! une! sonde! qui! se! fixe! sur! l’ATP! dans! la! matrice! mitochondriale!(ATeams,!GO=ATeam2)!(Imamura!et!al.!2009;!Lefkimmiatis!et!al.!2013;!Nakano!et!al.! 2011).!!
Le!taux!d’EAO!intracellulaire!est!affecté!dans!des!cellules!dont!la!quantité!d’OPA1!est!diminuée!
Contrairement!à!ce!qui!a!été!démontré!chez!la!drosophile!(Tang!et!al.!2009),!la!diminution!de! la!quantité!d’OPA1!aboutit!une!diminution!du!taux!d’EAO!intracellulaire!total!dans!les!neurones!(6! jours! après! la! transfection! du! siOPA1)! (Bertholet! et! al.! 2013)! et! les! cellules! HeLa! (3! jours! après! la! transfection!du!siOPA1),!mesuré!à!l’aide!de!la!sonde!H2=DCFDA.!Le!taux!intracellulaire!total!de!NADH,! H+!restant!inchangé!dans!les!cellules!HeLa!invalidées!pour!OPA1,!nous!supposons!que!le!complexe!I,! stable!malgré!la!diminution!de!la!dynamine,!est!suffisamment!alimenté!en!substrats.!Le!complexe!I! capterait!donc!les!électrons!de!l’équivalent!réduit!NADH,!H+!mais!le!transfert!aux!autres!complexes! serait! ralenti,! comme! en! témoigne! la! diminution! de! la! respiration.! Ces! résultats! suggèrent! que! la! quantité! d’électrons! libres! augmenterait! au! niveau! du! complexe! I! dans! les! cellules!déplétées! pour! OPA1,! ce! qui! favoriserait! leur! interaction! avec! l’oxygène! libre,! phénomène! à! l’origine! d’une! production!d’anion!superoxyde!dans!la!mitochondrie!(Turrens!1997;!Turrens!2003).!Cette!hypothèse! est!en!accord!avec!la!diminution!de!l’activité!de!l’aconitase!que!nous!avons!observée!dans!les!deux! modèles! cellulaires! (Tretter! et! al.! 2011).! Pour! appuyer! ces! arguments,! nous! pourrions! utiliser! la! sonde!MitoSOX!qui!s’accumule!dans!la!mitochondrie!et!devient!fluorescente!au!contact!de!l’anion! superoxyde! (Yang! et! al.! 2014).! D’autres! indicateurs! du! taux! d’EAO,! qui! ont! été! développés! ces! dernières! années,! permettent! des! mesures! plus! sensibles! et! en! temps! réel! du! statut! redox! intracellulaire! in& vitro! et! in& vivo! (Lukyanov! and! Belousov! 2014;! Wang! et! al.! 2013).! Par! exemple,! la!
protéine!fluorescente!HyPer!permet!une!mesure!spécifique!du!taux!de!peroxyde!d’hydrogène!(H202)! car!l’oxydation!des!résidus!cystéines!par!ce!radical!oxygéné!modifie!la!longueur!d’onde!d’excitation! de!HyPer!de!420!à!500!nM!(Belousov!et!al.!2006).!Les!sondes!roGFPs!(redox!oxidation=sensitive!green! fluorescent! protein)! permettent! de! rendre! compte! du! potentiel! redox! intracellulaire! car! elles! sont! sensibles! à! l’oxydation! et! les! formes! oxydées! et! réduites! ne! présentent! pas! les! mêmes! longueurs! d’onde!d’excitation,!qui!de!plus!varient!en!fonction!du!type!de!roGFPs!(de!1!à!6!roGFPs)!(Dooley!et!al.! 2004;!Hanson!et!al.!2004).!Cet!outil!pourrait!être!utilisé!en!parallèle!des!dosages!des!formes!réduites! et!oxydées!du!glutathion!que!nous!avons!déjà!réalisés.!En!effet,!le!niveau!de!glutathion!réduit!est! très!élevé!dans!nos!deux!modèles!cellulaires!diminués!pour!OPA1,!ce!qui!suggère!une!activation!du! métabolisme!du!glutathion!(Takaya!et!al.!2012;!Yuyun!et!al.!2013).!Les!dosages!ayant!été!réalisés!72h! et! 6! jours! après! transfection! par! le! siOPA1! pour! les! cellules! HeLa! et! les! neurones! respectivement,! nous!pourrions!suivre!le!statut!redox!des!cellules!pendant!plusieurs!heures!après!l’extinction!d’OPA1.! En!effet,!nous!avons!pu!constater,!dans!les!cellules!HeLa!déplétées!pour!OPA1,!que!le!niveau!d’EAO! intracellulaire!mesuré!par!la!sonde!H2=DCFDA!à!48h!était!identique!au!contrôle!et!qu’à!56h!le!taux! d’EAO! commençait! à! diminuer.! Les! sondes! roGFP! rendraient! compte! du! statut! redox! entre! 48h! et! 56h!de!transfection!afin!de!comprendre!la!réponse!intracellulaire!mise!en!jeu!suite!à!la!perte!d’OPA1.! De!plus,!nous!pourrions!obtenir!des!informations!sur!l’origine!de!cette!diminution!car!ces!protéines! fluorescentes! peuvent! être! adressées! aux! différents! compartiments! intracellulaires,! comme! la! mitochondrie! (Dooley! et! al.! 2004;! Hanson! et! al.! 2004).! Enfin,! un! autre! argument! en! faveur! de!! l’implication!d’OPA1!dans!la!production!d’EAO!vient!d’un!modèle!drosophile!qui!exprime!des!clones!
OPA1Z/Z!présents!uniquement!dans!les!yeux!de!l’insecte!(Yarosh!et!al.!2008).!En!effet,!la!perte!totale!
d’OPA1!induit!un!phénotype!de!l’œil!dit!rugueux!et!brillant,!caractéristique!d’une!perte!des!cellules! hexagonales!et!d’une!altération!des!cônes!et!des!cellules!pigmentées,!suggérant!une!augmentation! de! l’apoptose.! En! présence! de! vitamine! E! ou! de! SOD1! dans! la! nourriture,! ou! en! sur=exprimant! la! forme!humaine!de!SOD1,!le!phénotype!de!l’œil!s’approche!d’un!phénotype!sauvage!suggérant!la!part! importante!des!EAO!dans!la!mort!des!cellules!OPA1Z/Z!de!l’œil!de!l’insecte.!!
La!voie!de!signalisation!de!NRF2!est!activée!en!réponse!à!la!diminution!de!quantité!d’OPA1!
! Un! autre! argument! en! faveur! de! la! diminution! des! EAO! intracellulaires! totaux! dans! nos! modèles!est!l’activation!des!défenses!antioxydantes.!Nous!avons!pu!montrer!que!la!diminution!de!la! protéine! OPA1! dans! des! neurones! et! des! cellules! HeLa! induit! une! relocalisation! du! facteur! de! transcription!NRF2!au!noyau,!signe!de!son!activation!(Gan!and!Johnson!2013;!Takaya!et!al.!2012;!de! Vries!et!al.!2008).!De!plus,!ce!phénomène!est!visible!dès!67h!après!transfection!des!cellules!HeLa!par! le! siOPA1.! Nous! pouvons! donc! supposer! qu’une! augmentation! du! taux! d’EAO! intracellulaire,! en! amont!de!cette!cinétique,!est!suffisante!pour!dissocier!le!complexe!NRF2/Keap=1!et!permettre!une!
relocalisation! massive! de! NRF2! dans! le! noyau.! De! plus,! les! quantités! protéiques! et/ou! l’activité! enzymatique! de! cibles! de! NRF2,! comme! les! superoxydes! dismutases,! la! catalase! ou! GSTP1,! sont! augmentées! dans! nos! modèles! cellulaires! invalidés! pour! OPA1.! Clairement,! la! diminution! d’OPA1! engendre! une! signalisation! antioxydante! qui! serait! responsable! de! la! diminution! du! taux! d’EAO! observé!6!jours!ou!72h!après!transfection!des!neurones!ou!des!cellules!HeLa!respectivement.!!
En!plus!du!rôle!largement!décrit!de!NRF2!dans!la!réponse!au!stress!oxydatif!par!l’activation! des! défenses! antioxydantes,! le! facteur! de! transcription! est! intimement! lié! au! métabolisme! énergétique! cellulaire.! En! effet,! Heiss! EH! et! collègues! ont! montré! que! l’activation! de! NRF2,! par! l’inducteur!sulforaphane!ou!par!un!KO!de!l’inhibiteur!Keap=1!dans!des!MEFs,!induit!une!modification! du!métabolisme!intracellulaire!où!la!molécule!de!glucose!est!préférentiellement!dégradée!par!la!voie! des!pentoses!phosphates!(Heiss!et!al.!2013).!Nous!pouvons!suggérer!que,!en!plus!de!l’activation!des! défenses! antioxydantes! comme! nous! l’avons! démontré,! la! diminution! d’OPA1! engendre! un! changement!métabolique!des!cellules!de!la!mitochondrie!vers!la!voie!des!pentoses!phosphates.!De! plus,!le!lactate!extracellulaire!dans!les!cellules!HeLa!invalidées!pour!OPA1!est!stable.!Ainsi,!même!si! les!cellules!HeLa!sont!principalement!glycolytiques!du!fait!de!leur!origine!cancéreuse!(Klepinin!et!al.! 2014;!Palsson=McDermott!and!O’Neill!2013;!Xie!et!al.!2014),!la!diminution!d’OPA1!n’augmente!pas!la! production! de! lactate! dans! nos! conditions.! Nous! pourrions! donc! analyser! la! voie! des! pentoses! phosphates!dans!nos!modèles!afin!d’approfondir!les!mécanismes!métaboliques!qui!découlent!d’une! diminution!d’OPA1.!
Les!neurones!dont!la!quantité!d’OPA1!est!diminuée!sont!plus!sensibles!au!stress!oxydatif!induit!par! la!roténone!
Pour! déterminer! les! mécanismes! intracellulaires! mis! en! jeux! chez! les! patients! atteints! d’ADOA=1! qui! subissent! comme! tout! un! chacun! des! stress! exogènes! au! quotidien,! comme! les! UVs! (Kushibiki!et!al.!2013)!ou!l’hypoxie!transitoire!dans!l’œil,!nous!avons!induit!un!stress!oxydatif!dans! des! neurones! transfectés! par! un! siOPA1.! Tout! comme! dans! les! modèles! invertébrés! (drosophile,!
C.Elegans)& porteurs! de! mutations! du! gène! OPA1& (Kanazawa! et! al.! 2008;! Tang! et! al.! 2009),& les!
neurones!ex&vivo& présentent! une!sensibilité! accrue!à!un!stress! oxydant.! En! effet,! après!traitement! «!aigu!»!ou!«!chronique!»!par!la!roténone!(inhibiteur!du!complexe!I)!des!cellules!traitées!par!siOPA1,! la!mort!cellulaire!est!plus!importante!que!dans!les!conditions!contrôles.!Nous!avons!de!plus!observé! que! les! défenses! antioxydantes! ne! sont! pas! activées! en! réponse! à! ce! traitement.! En! effet,! la! translocation!de!NRF2!augmente!dans!les!cellules!contrôles!traitées!par!la!roténone!mais!pas!dans! celles!qui!sont!invalidées!pour!OPA1.!De!plus,!les!quantités!protéiques!de!SOD1!et!catalase!restent! stables!voir!diminuent!après!le!traitement!aigu!à!la!roténone.!Nous!pouvons!donc!proposer!que!la!
sensibilité! des! cellules! à! un! stress! oxydant! soit! la! conséquence! d’une! saturation! de! la! machinerie! antioxydante,!suite!à!la!diminution!d’OPA1.!Ces!résultats!rappellent!les!travaux!de!Jin!et!collègues! dans!des!cellules!striatales!modèles!de!la!maladie!de!Huntington.!Suite!à!un!stress!oxydatif!induit!par! le! t=BHQ! (tert=butylhydro=quinone),! les! cellules! qui! expriment! une! forme! délétère! de! la! protéine! huntingtin! (Htt)! ne! présentent! pas! d’activité! ARE,! donc! pas! d’activation! de! la! voie! NRF2,! contrairement!aux!cellules!contrôles!(Jin!et!al.!2013).!!
Dans!notre!cas,!l’activation!de!NRF2!suite!à!la!perte!d’OPA1!ne!semble!pas!induire!la!cible! SOD2,! ni! en! condition! «!basale!»! ni! en! présence! de! roténone.! Or! cette! enzyme! est! directement! impliquée! dans! la! détoxification! de! l’anion! superoxyde! produit! au! niveau! de! la! matrice! mitochondriale! par! les! complexes! I,! II! et! III.! Sachant! que! d’autres! facteurs! de! transcription! sont! également! impliqués! dans! la! transactivation! du! gène! codant! SOD2,! comme! AP=2! et! Sp1,! ou! l’inhibition!de!la!transcription,!comme!Egr=1!(Porntadavity!et!al.!2001),!nous!pouvons!donc!supposer! un!autre!mécanisme!de!régulation!pour!cette!cible!dans!nos!modèles.!SOD2!semble!être!une!cible! intéressante! car! la! déplétion! de! cette! protéine! par! interférence! à! l’ARN! (siRNA)! chez! les! vers! C.&
Elegans!invalidés!pour!OPA1!(mutations!ou!siRNA)!diminue!drastiquement!la!taille!de!la!progéniture,!
contrairement! à! l’extinction! de! SOD1! (Kanazawa! et! al.! 2008).! Comme! en! témoignent! les! données! chez!ce!modèle!invertébré!de!l’ADOA=1,!analyser!la!régulation!transcriptionnelle!de!SOD2!serait!une! piste!de!compréhension!de!l’étiologie!de!cette!rétinopathie.!
Un!modèle!de!souris!de!l’ADOA;1!est!dans!un!état!pro;oxydant!
Une! des! souris! modèles! de! l’ADOA=1,! B6;C3=Opa1329=355del!(OPA1+/Z)! (Alavi! et! al.! 2007),! est!
arrivée!tardivement!au!cours!de!ma!thèse!dans!le!laboratoire.!Je!n’ai!donc!pas!pu!réaliser!un!grand! nombre!d’expériences!sur!ce!modèle.!Toutefois,!les!résultats!indiquent!clairement!que!les!souris!sont! dans!un!état!pro=oxydant!à!4!mois,!qui!s’accentue!à!10!mois.!En!effet,!la!diminution!de!l’activité!de! l’aconitase!à!4!mois,!accentuée!à!10!mois,!montre!une!augmentation!des!EAO!intra=mitochondriaux! avec!l’âge,!dans!le!cortex!des!souris!mutantes.!Nous!pouvons!suggérer,!avec!ces!premiers!résultats,! que! les! souris! OPA1+/Z! subissent! un! vieillissement! prématuré.! En! effet,! le! vieillissement! est! généralement!associé!à!une!augmentation!des!radicaux!libres,!ce!qui!est!le!cas!dans!notre!modèle!de!