• Décongélation!des!ampoules!de!cellules!HeLa!
! Les! ampoules! de! cellules! sont! conservées! dans! un! container! à! azote! liquide.! Les! cellules! congelées! sont! resuspendues! avec! du! milieu! Dulbecco’s! Modified! Eagle’s! Medium! 4,5! g/L! glucose! (DMEM,! Invitrogen),! supplémenté! avec! du! sérum! de! veau! fœtal! (10! %)! et! des! antibiotiques! (pénicilline! 100unités/mL! et! streptomycine! 0,1! mg/mL),! préalablement! chauffé! à! 37°C.! Puis! les! cellules!sont!centrifugées!à!120!g!pendant!6!minutes!et!à!25°C.!Le!culot!cellulaire!est!repris!dans!du! milieu! et! les! cellules! ont! été! placées! dans! une! boîte! de! pétri! de! 10cm! de! diamètre! (P100)! mise! ensuite!à!l’incubateur!à!37°C!et!5!%!de!CO2.!
• Maintien!de!la!culture!
! A!70=80!%!de!confluence!maximum,!les!cellules!sont!rincées!dans!du!PBS!1X!et!décollées!avec! 400! µL! de! trypsine! pendant! 5! minutes! à! 37°C.! Puis! elles! sont! resuspendues! dans! du! milieu! chaud! après! avoir! été! comptées! à! l’aide! d’une! cellule! de! Malassez.! Le! nombre! de! passages! des! cellules! n’excède!pas!25.!
• Congélation!de!cellules!HeLa!
! Les!cellules!sont!décollées!à!l’aide!de!la!trypsine,!comptées!et!centrifugées!à!120!g!pendant!6! minutes!à!25°C.!Le!culot!de!cellules!est!repris!dans!un!milieu!de!congélation!(90!%!de!sérum!de!veau! fœtal! et! 10! %! DMSO).! Les! cellules! sont! ensuite! mises! dans! une! boîte! de! congélation! au! =80°C! et! transférées!dans!de!l’azote!liquide.!
Les!cellules!HeLa!ont!été!transfectées!avec!le!kit!«!Cell!line!kit!R!»!(Amaxa)!par!des!siARNs! contrôles!(D=001210=02,!Dharmacon!Research,!siContrôles)!ou!dirigés!contre!l’ARN!messager!d’OPA1! (D=005273=03,! AAAGAAGGCUGUACCGUUA,! Dharmacon! Research,! siOPA1)! en! suivant! les! recommandations! des! fournisseurs! (1,5! µg! de! siARN! pour! 1! million! de! cellules)! et! en! utilisant! le! programme!I=013.!!
!
I. 2. Culture de fibroblastes humains
Les!fibroblastes!sont!issus!de!biopsies!de!peau!de!personnes!saines!(contrôles)!ou!de!patients! atteints! d’ADOA=1.! Ces! cellules! proviennent! d’un! don! de! l’équipe! du! Pr! Pascal! Reynier! du! CHU! d’Angers.!
La!culture!cellulaire!
Les! conditions! de! culture! des! fibroblastes! de! patients! sont! les! mêmes! que! celles! utilisées! pour!les!cellules!HeLa.!Toutefois,!le!nombre!de!passages!de!ces!cellules!n’excède!pas!15.!
!
I. 3. Culture primaire et transfection de neurones corticaux embryonnaires de
rats (E17)
Les!neurones!corticaux!sont!prélevés!sur!des!embryons!au!stade!E17!issus!de!rates!Wistar! gestantes.!Les!animaux!sont!maintenus!dès!leur!arrivée!dans!une!pièce!éclairée!12!heures!par!jour,!à! la!température!de!22°C!et!disposent!d’eau!et!de!nourriture!à!volonté.!La!culture!cellulaire!
• Recouvrir!les!boîtes!de!culture!24h!avant!la!mise!en!culture!des!cellules!! Pour! permettre! l’adhérence! des! neurones,! les! boîtes! de! culture! sont! incubées! avec! de! la! poly=D=lysine!(Sigma,!PM!30000=70000,!P7280)!diluée!à!la!concentration!de!1X!final!dans!du!PBS!1X.!
• Dissection!des!embryons!
Les! rates! sont! anesthésiées! par! injection! intra=péritonéale! de! pentobarbital! sodique! (100! mg/kg).! L’abdomen! est! incisé,! les! deux! cornes! utérines! sorties! puis! les! sacs! vitellins! extraits.! Les! fœtus!sont!prélevés,!les!têtes!sectionnées!et!rincées!dans!du!PBS=glucose!(6!g/L)!à!4°C.!La!dissection!
des!cortex!est!effectuée!sous!loupe!binoculaire!dans!du!PBS=glucose!(6!g/L)!à!4°C!puis!les!cortex!sont! transférés!dans!une!quantité!minimale!de!PBS!à!4°C!(environ!10!cortex!par!tube!Falcon!15!mL).!
• Mise!en!culture!
Une! dissociation! enzymatique! du! tissu! est! réalisée! à! l’aide! d’une! solution! de! papaïne! (10U/mL)! dans! du! PBS! 1X! pendant! 15! minutes! à! 37°C,! sans! agitation.! La! réaction! est! stoppée! par! addition! d’une! solution! de! DNAse! (200U/mL)! et! de! B27! (1X)! dans! du! PBS=glucose,! 5! minutes! à! température!ambiante.!A!l’aide!d’une!pipette,!une!dissociation!mécanique!est!réalisée!grâce!à!une! dizaine! d’«! aller=retour! ».! La! suspension! cellulaire,! une! fois! trouble,! est! filtrée! (filtres! 70! µM)! puis! déposée!sur!coussin!de!BSA!stérilisée!par!des!filtres!de!20!µM!(80!mg/mL!repris!dans!du!Neurobasal)! et!centrifugée!à!120!g!pendant!10!minutes!à!température!ambiante.!Chaque!culot!est!repris!dans!5! mL!milieu!complet.!!
Avant!ensemencement,!les!boîtes!de!cultures!préalablement!recouvertes!avec!de!la!poly=D= lysine! sont! rincées! avec! du! PBS! 1X.! Les! cellules! sont! comptées! avec! une! cellule! de! Malassez,! ensemencées! à! 400! 000! cellules! par! mL! (600! 000! cellules! par! boîte! P35)! et! placées! dans! un! incubateur!à!37°C!et!5!%!de!CO2.! • Les!solutions,!milieux!et!réactifs! =!PBS!sans!Ca2!+!Mg2!+!(Eurobio!CS1PBS01=01)! =!D=(+)=Glucose!45!%!(Sigma!G8769,!450!g/L)! =!Papaïne!(Sigma,!P4762)! =!DNAse!(Invitrogen,!18047=019,!200U/mL)! =!BSA!(culture!grade,!Sigma!A8806=5!g)! Milieu!de!culture!:! =!Neurobasal!A=25!(Invitrogen,!10888=022)! =!Antibiotiques!(Penicillin/Streptomycin!10000U/mL,!SigmaP0781)! =!Antifongique!(Fongizone!250U/mL,!Invitrogen!15290=50!mL)! =!Acide!L!lactique!(Sigma!L1750),!0,9!mg/mL!H2O!final! =!B27!serum=free!supplement!50x!(Invitrogen,!17504=44)! =!Glutamine!1!mM!final!(Invitrogen!25030=024)!
Transfection!des!neurones!par!électrolocation!
Les!neurones!sont!transfectés!avec!le!kit!«!Rat!Neurons!»!(Amaxa)!par!des!siARNs!contrôles! (D=001210=02,! Dharmacon! Research,! siContrôle)! ou! dirigés! contre! l’ARN! messager! d’OPA1! (D= 086996=02,! GAUUGUGCCUGACUUUAUA,! Dharmacon! Research,! siOPA1)! en! suivant! les! recommandations!des!fournisseurs!et!en!utilisant!le!programme!G=013.!Cinq!millions!de!cellules!sont! transfectées!avec!3!µg!de!si!et!réparties!après!électrolocation,!et!ajout!de!500!µL!de!milieu!chaud,! dans!3!boites!P35!et!mises!à!l’incubateur!à!37°C,!5!%!CO2.!La!moitié!du!milieu!de!culture!est!changé! 2h!minimum!après!transfection.!
!
II. Dissections et microdissections d’organes de souris
II. 1. Dissection et microdissection de la rétine de souris adulte
Dissection!de!l’œil!!
! Les!paupières!sont!coupées!(micro=ciseaux)!tout!autour!de!l’œil.!A!l’aide!d’une!seringue,!l’œil! est!rincé!avec!PBS!1X!froid!afin!de!le!débarrasser!des!poils.!Les!attaches!derrières!le!globe!oculaire! sont!sectionnées!(conjonctive,!nerf!optique)!en!faisant!attention!de!ne!pas!toucher!le!sinus!veineux! derrière!l’œil.!Le!globe!est!ensuite!placé!dans!une!boîte!de!pétri!remplie!de!PBS!1X!froid.!!Microdissection!de!la!rétine!!
! L’œil! est! déposé! dans! une! goutte! de! PBS! 1X! sous! une! loupe! binoculaire! (fond! noir).! Pour! débuter! la! microdissection,! le! globe! est! maintenu! par! les! adhérences! encore! présentes.! Une! première!incision!au!niveau!de!l’œil!est!réalisée!à!l’aide!d’une!aiguille!fine,!pour!traverser!la!cornée.! Le! contour! de! l’œil! est! découpé! avec! les! micro=ciseaux! pour! détacher! le! cristallin.! La! rétine! est! désormais!visible!est!se!détache!facilement!du!reste!de!l’œil.!C’est!un!feuillet!blanchâtre!fragile!donc! il!faut!la!retirer!avec!précaution.!Une!partie!de!l’iris!peut!rester!attachée!à!la!rétine!(tissus!noir).!Elle! doit!être!retirée!pour!isoler!seulement!la!neuro=rétine.!La!rétine!est!récupérée,!placée!dans!un!tube! et!aussitôt!congelée!dans!l’azote!liquide.!Elle!peut!être!conservée!au!=80°C.!!
!
II. 2. Dissection d’organes de souris adulte
Le!cortex!cérébral!!
Après! avoir! retiré! la! peau! de! la! boîte! crânienne,! l’os! est! découpé! à! la! base! du! crâne! en! remontant! vers! le! museau,! en! faisant! attention! de! ne! pas! endommager! le! cortex! sous=jacent.! La! calotte!crânienne!est!ensuite!retirée!de!façon!à!mettre!les!2!hémisphères!à!nu.!Le!cerveau!est!décollé! délicatement!de!la!boîte!crânienne!puis!placé!côté!dorsal!vers!le!haut.!Le!cervelet!et!retiré!du!reste!à! l’aide!de!pinces!fines.!Ensuite,!le!cerveau!est!retourné!face!ventrale!pour!dérouler!les!hémisphères! du! centre! vers! l’extérieur.! Les! hippocampes! sont! visibles! sous! forme! d’amas! allongés!:! ils! sont! séparés!du!cortex.!En!utilisant!les!branches!des!pinces!(pas!les!pointes),!la!base!inférieure!du!cortex! est!raclée!doucement,!de!façon!à!éliminer!le!thalamus!et!la!matière!blanche!riche!en!myéline.!Cette! étape! est! très! délicate! car! les! hémisphères! ont! tendance! à! se! disloquer.! Enfin,!retourner! les! hémisphères!pour!vérifier!qu’ils!forment!une!petite!tranche!amincie!et!homogène!de!surface!lisse!et! un! peu! rosée.! Les! placer! dans! des! tubes! et! les! congeler! aussitôt! dans! de! l’azote! liquide.! Le! cortex! peut!ainsi!être!conservé!à!=80°C.!