Dissection!de!certains!organes!périphériques!!
III. Analyses de la chaîne respiratoire mitochondriale et du cycle de Krebs
III. 1. Respiration cellulaire par la technique Seahorse Biosciences
! La! respiration! cellulaire! est! analysée! dans! deux! types! cellulaires!:! les! neurones! en! culture! primaire!et!les!cellules!HeLa!respectivement!transfectées!avec!un!siContrôle!ou!un!siOPA1.!L’appareil! de!mesure!de!consommation!d’oxygène!est!le!«!XF24!Extracellular!Flux!Analyser!»!et!le!kit!utilisé!est! «!XF!Cell!Mito!Stress!Test!Kit!»!(101706=100,!Seahorse!Biosciences).!
Ensemencement!des!cellules!dans!la!plaque!Seahorse!(plaque!«!bleue!»)!
La! plaque! est! ensemencée! avec! 300! 000! neurones! transfectés! par! puits! (coatés! 24h! avant! avec!de!la!poly=D=lysine)!ou!15!000!cellules!HeLa!transfectées!par!puits!(20!puits/24).!Les!puits!A1,!B2,! C4!et!D6!ne!sont!pas!ensemencés!(seulement!du!milieu!de!culture)!et!servent!de!contrôle!négatif.! Pour!optimiser!l’ensemencement,!les!cellules!sont!déposées!au!fond!du!puits!dans!une!goutte!de!50! µL!puis!incubées!à!37°C,!5!%!de!CO2!pendant!environ!1h.!Puis,!200!µL!de!milieu!sont!ajoutés!à!chaque! puits.! Les!analyses!sont!réalisées!72h!après!transfection!et!mise!en!culture!des!cellules!HeLa!et!à! DIV6!pour!les!neurones!transfectés.!!
Préparation!de!la!plaque!de!mesure!(plaque!«!verte!»)!24h!avant!analyse!
! Il!est!impératif!d’hydrater!la!plaque!de!mesure!avec!1!mL!de!«!Calibrant!»!par!puits.!Cette! plaque!est!incubée!dans!une!étuve!à!37°C,!sans!CO2.!Un!bécher!d’eau!stérile!est!placé!à!côté!de!la! plaque!pour!créer!un!milieu!humide.!Les!mesures!de!respiration!cellulaire!au!«!Seahorse!»!
! Avant! la! mesure! de! la! respiration,! le! plaque! «!verte!»! est! maintenue! dans! le! «!Calibrant!»! dans!une!étuve!à!37°C!sans!CO2.!Le!milieu!de!mesure!a!été!préparé!à!l’avance!et!chauffé!à!37°C!:! DMEM!(D5030=1!L,!Sigma),!NaCl!(143!mM,!S9625,!Sigma),!rouge!de!phénol!(3!mg/mL),!glucose!(10! mM,!G8769,!Sigma),!L=glutamine!(2!mM,!G6392=1VL,!Sigma)!et!pyruvate!(2!mM,!P5280,!Sigma),!à!pH! 7,4.!
Les!puits!de!la!plaque!«!bleue!»!sont!rincés!2!fois!avec!le!milieu!de!mesure!(environ!800!µL! par!puits!et!par!lavage).!Ensuite,!exactement!550!µL!de!milieu!de!mesure!est!déposé!dans!chaque! puits!et!la!plaque!est!incubée!à!37°C!dans!une!étuve!sans!CO2,!pendant!environ!1h.!
• Préparation!de!la!plaque!«!verte!»!
Pendant! ce! temps,! faire! le! calcul! des! volumes! de! drogues! à! ajouter! spécifiquement! par! «!micro=puits!»!de!la!plaque!«!verte!».!Chaque!puits!de!la!plaque!dispose!de!4!«!micro=puits!»!autour! de!la!sonde!pour!déposer!le!volume!de!drogue!requis.! Le!plan!des!zones!des!«!micro=puits!»!sur!la!plaque!«!verte!»!:!!!!D!!!!!!C! !!!! ! ! ! ! ! ! ! ! B!!!!!!!A! L’ordre!d’injection!des!drogues!dans!le!milieu!de!culture!des!cellules!lors!de!la!mesure!est!de! A!à!D.!Les!drogues!utilisées!sont!fournies!avec!le!kit!et!reprises!dans!du!DMSO!à!une!concentration! initiale!de!25!mM.! ! Tableau!récapitulatif!de!la!concentration!finale!des!drogues!
Les!drogues! Neurones! HeLa!
A!:!Oligomycine! 0,6!µM! 1!µM! B!:!FCCP! 6!µM! 1!µM! C!:!Roténone! +!Antimycine! 50!nM! 0,182!µM! 1!µM! 1!µM! FCCP&:&Carbonyl&cyanide&4Z(trifluoromethoxy)phenylhydrazone#
Les! drogues! sont! déposées! dans! les! «!micro=puits!»! 10! fois! plus! concentrées! que! la! concentration!finale!désirée.!Pour!la!zone!A,!55!µL!de!drogue!est!déposé!car!elle!est!éjectée!dans!550! µL!de!milieu!de!culture,!lors!de!la!mesure.!Pour!la!zone!B!il!faut!prévoir!60!µL!et!la!zone!C!65!µL.!La! zone!D!n’a!pas!été!utilisée!lors!des!expériences.!
• Programmation!de!l’appareil!Seahorse!et!mesures!
! Un!protocole!a!été!mis!au!point!pour!nos!types!cellulaires!:!l’appareil!effectue!3!à!4!mesures! par! «!état! respiratoire!»,! avant! l’ajout! de! drogues! et! après! chaque! drogue! injectée.! Une! fois! les! paramètres!déterminés,!la!plaque!«!verte!»!est!insérée!(attention!au!sens!qui!dépend!du!code!barre)! dans! l’appareil! suivi! de! la! plaque! bleue! pour! débuter! l’enregistrement! de! la! consommation! d’oxygène.!!
Les! activités! respiratoires! mesurées! sont! normalisées! sur! la! quantité! de! protéines! déterminée!par!la!technique!de!Bradford.!
!
III. 2. Mesure de l’activité des complexes I, II, III et IV de la chaîne respiratoire
mitochondriale
Les!dosages!des!activités!des!4!premiers!complexes!de!la!chaîne!ont!été!effectués!à!partir!de! culots!de!cellules!HeLa!transfectées!par!siOPA1!ou!siContrôle.!Les!complexes!I!et!III!ont!été!dosés!par! Dr!Christine!Demeilliers!(Université!Joseph!Fourier,!Grenoble)!et!l’activité!des!complexes!II!et!IV!a!été! mesurée!par!Virginie!Agier!et!Dr!Anne!Lombès!(Hôpital!de!la!Pitié!Salpêtrière,!Paris).!Dosage!du!complexe!I!(Christine!Demeilliers,!Université!Joseph!Fourier,!Grenoble)!
• Principe!du!dosage! ! Le!complexe!I!de!la!chaîne!respiratoire!permet!l’oxydation!du!NADH!en!NAD+!et!le!transfert! les!électrons!du!NADH!au!coenzyme!Q.!Son!activité!est!donc!évaluée!par!la!disparition!du!NADH!qui! absorbe! à! 340! nm.! L’accepteur! naturel! des! électrons! du! complexe! I! est! le! coenzyme! Q10! ou! ubiquinone.!Cette!molécule!très!hydrophobe!est!remplacée!dans!l’essai!!par!la!décylubiquinone,!plus! hydrophile.!Les!autres!activités!cellulaires!(non!respiratoires)!d’oxydation!du!NADH!sont!insensibles!à!la! roténone,! un! inhibiteur! de! complexe! I.! L’oxydation! du! NADH! est! donc! mesurée! avant! (pendant! 2! minutes)!et!après!l’ajout!de!roténone!dans!la!cuve.!!
• Méthode!utilisée! !
Après!décongélation!du!culot!de!cellules!(2!millions),!les!cellules!sont!resuspendues!dans!205! µL!de!tampon!Kpi!50!mM!pH!7,5!froid.!Puis!les!cellules!sont!recongelées!dans!de!l’azote!liquide!et! décongelée!au!bain!marie!à!37°C,!deux!fois!pour!permettre!une!lyse!complète!de!l’échantillon.!!
L’activité! du! complexe! I! est! déterminée! par! l’oxydation! du! NADH! à! 340! nm.! Le! milieu! réactionnel! comprend! 855! µL! de! tampon! KPi! 50mM! pH! 7,5! chaud,! 10! µL! de! NADH! 10! mM,! et! un! million! de! cellules.! Après! calibration! de! la! lecture! à! 340! nm,! à! 37°C! sur! l’air,! la! réaction! est! déclenchée!par!ajout!de!5!µL!de!décylubiquinone!20!mM!et!la!Do!est!lue!pendant!2!minutes!sans! roténone,!puis!2!minutes!après!ajout!de!5!µL!de!roténone!2!mM.!L’activité!spécifique!est!calculée! après! soustraction! de! l’activité! en! présence! de! roténone! sur! l’activité! de! base! en!!
µmoles/min/million!de!cellules!en!utilisant!le!coefficient!d’extinction!pour!le!NADH!(ε=6.22!mmole= 1.cm=1).!L’activité!a!été!rapportée!à!la!quantité!de!protéines!en!mg!(dosage!Bradford).!
Dosage!du!complexe!II!(Virginie!Agier!et!Anne!Lombès,!Hôpital!de!la!Pitié!Salpêtrière,!Paris)!
• Principe!du!dosage! !
Le! complexe! II! de! la! chaîne! respiratoire! permet! l’oxydation! du! succinate! en! fumarate! et! transfère! les! électrons! au! coenzyme! Q10! ou! ubiquinone.! Ces! électrons! sont! ensuite! transmis! à! un! accepteur! artificiel,! le! 2,6=dichlorophénol=indophénol! (DCPIP).! L’ubiquinone! très! hydrophobe! est! remplacée!dans!l’essai!par!la!décylubiquinone!beaucoup!plus!hydrophile.!L’activité!est!mesurée!en! suivant!la!réduction!du!DCPIP!à!600!nm.!L’oxydation!de!l’ubiquinone!par!le!complexe!III!est!inhibée! par!l’antimycine!et!le!flux!réverse!des!électrons!vers!le!complexe!I!est!inhibé!par!la!roténone.!Une! ligne!de!base!est!mesurée!pour!pouvoir!soustraire!une!réaction!spontanée!de!transfert!d’électrons! au!DCPIP.! • Méthode!utilisée! ! Le!milieu!de!réaction!utilisé!est!composé!de!25!mM!K!Phosphate!pF!7,5,!20!mM!succinate,! 100!µM!décylubiquinone,!50!µM!DCPIP,!1!mM!KCN,!5!µM!roténone,!12,5!µg/mL!antimycine!A,!100! µM!ATP,!2!mg/mL!BSA.!Dans!une!cuve!de!mesure,!976!µL!de!milieu!de!réaction!sont!dosés!avec!40!µg! de! protéines! cellulaires,! préalablement! homogénéisés.! Après! calibration! de! la! lecture! à! 600! nm,! à! 37°C!sur!l’air,!une!ligne!de!base!est!lue!pendant!3!minutes!puis!la!réaction!est!déclenchée!par!ajout! de! 4! µL! de! 25! mM! de! décylubiquinone.! L’activité! spécifique! est! calculée! après! soustraction! de! l’activité! de! base! en! nmoles/min/mg! de! protéines! en! utilisant! le! coefficient! d’extinction! pour! le! DCPIP!(ε=19,1).!
Dosage!du!complexe!III!(Christine!Demeilliers,!Université!Joseph!Fourier,!Grenoble)!
• Principe!du!dosage! !
! Le!complexe!III!de!la!chaîne!respiratoire!permet!l’oxydation!de!l’ubiquinol!(forme!réduite!de! l’ubiquinone)!et!le!transfert!des!électrons!au!cytochrome!c.!La!réduction!du!cytochrome!c!induit!une! augmentation! de! l’absorbance! à! 550! nm.! Des! activités! cellulaires! non! respiratoires! induisent! aussi! l’oxydation! de! l’ubiquinol.! Ainsi,! l’activité! spécifique! du! complexe! III! est! calculée! par! la! différence! entre!l’activité!totale!et!celle!en!présence!d’antimycine!A.!!
Après!décongélation!du!culot!de!cellules!(2!millions),!les!cellules!sont!resuspendues!dans!205! µL!de!tampon!Kpi!90,7!mM!pH!7,5!froid.!Puis!les!cellules!sont!recongelées!dans!de!l’azote!liquide!et! décongelée!au!bain!marie!à!37°C,!deux!fois!pour!permettre!une!lyse!complète!de!l’échantillon.!!
La! décylubiquinone! est! réduite! chimiquement! par! du! dithionite.! Le! milieu! réactionnel! contient! 105,6! µM! de! décylubiquinol,! 100! µM! de! cytochrome! c,! 100! mM! de! KPO4! pH! 7,5,! 50! µM! d’EDTA,!1!mM!de!cyanure!de!potassium!et!1!mg/mL!d’albumine!bovine.!L’inhibition!du!complexe!III! est!effectuée!avec!5!µg/mL!d’antimycine!A.!Après!calibration!de!la!lecture!à!550!nm,!à!30°C!sur!l’air,! la!réaction!est!déclenchée!par!ajout!de!8!µL!de!décylubiquinol!et!la!Do!est!lue!pendant!3!minutes,! pour!les!deux!cuves!avec!ou!sans!antimycine!A.!L’activité!spécifique!est!calculée!après!soustraction! de!l’activité!en!présence!d’antimycine!A!sur!l’activité!de!base!en!µmoles/min/million!de!cellules!en! utilisant!le!coefficient!d’extinction!pour!le!cytochrome!c!(ε=18.5).!
Dosage!du!complexe!IV!(Virginie!Agier!et!Anne!Lombès,!Hôpital!de!la!Pitié!Salpêtrière,!Paris)!
• Principe!du!dosage! ! Le!complexe!IV!de!la!chaîne!respiratoire!permet!l’oxydation!du!cytochrome!c,!son!activité!est! donc! évaluée! par! la! diminution! de! l’absorbance! à! 550! nm! du! cytochrome! c! réduit.! L’accepteur! naturel!des!électrons!du!complexe!IV!est!l’oxygène.!• Méthode!utilisée! !
Deux!solutions!de!référence!sont!préparées!:!la!solution!de!cytochrome!c!«!100!%!réduit!»!et! la! solution! «!100! %! oxydée!».! La! solution! 100! %! oxydée! est! préparée! avec! quelques! grains! de! ferricyanure! de! potassium! (la! solution! est! orange! sombre).! La! solution! 100! %! réduite! est! obtenue! avec! quelques! grains! de! dithionite! de! sodium! (bisulfite)! (la! solution! est! rose! saumon).! La! solution! utilisée!pour!le!dosage!est!réduite!progressivement!à!550!nm!avec!quelques!µL!de!la!solution!100!%! réduite.!Le!but!est!d’atteindre!une!réduction!de!90=95!%!calculée!sur!l’écart!entre!l’absorbance!des!2! solutions!100!%.!Le!milieu!de!réaction!utilisé!est!composé!de!25!mM!K!phosphate!pH!7,0,!50!µM!de! cytochrome! c! réduit! et! 20! µg! de! protéines.! La! lecture! de! la! Do! est! déclenchée! par! l’ajout! de! la! préparation! cellulaire! après! calibration! initiale! sur! l’air! à! 37°C,! à! 550! nm.! L’activité! spécifique! est! calculée!en!nmoles/min/!mg!de!protéines!en!utilisant!le!coefficient!d’extinction!pour!le!cytochrome!c! (ε=18,5).!
III. 3. Dosage des ROS intracellulaires totaux avec la sonde H
2-DCFDA
La! sonde! dichlorohydrofluorescéine! diacétate! (H2=DCFDA)! permet! la! détection! des! ROS! totaux!dans!la!cellule!(mitochondrie!et!cytoplasme).!Cette!sonde!diffuse!à!travers!la!membrane!des! cellules!puis!est!clivée!dans!le!cytosol!par!des!estérases!pour!donner!du!dichlorohydrofluorescéine! (H2=DCF).! La! forme! clivée! réagit! avec! les! espèces! actives! de! l’oxygène! (ROS)! pour! donner! du! dichlorofluorescéine! (DCF),! une! forme! fluorescente! de! la! molécule! excitable! à! 493! nm! et! qui! est! détectée!à!527!nm.!
Ensemencement!des!cellules!HeLa!
Le!dosage!des!ROS!est!effectué!dans!des!cellules!HeLa!transfectées!avec!du!siContrôle!ou!du! siOPA1.!Le!dosage!est!réalisé!à!partir!de!5!boîtes!de!60mm!de!diamètre!(P60)!«!avec!sonde!»!et!4! boîtes! «!sans! sonde!»! (contrôle)! par! condition! à! analyser.! Chaque! boîte! P60! est! ensemencée! avec! 300!000!cellules!HeLa!transfectées.!
Incorporation!de!la!sonde!dans!les!cellules!
A! l’abri! de! la! lumière,! la! sonde! est! incorporée! (4! µM! final)! directement! dans! le! milieu! de! culture!des!cellules!HeLa,!trois!jours!après!transfection.!Les!boîtes!P60!contrôles!sont!incubées!avec! du! DMSO! (4! µM! final),! le! véhicule! de! la! sonde.! Pour! éviter! toute! toxicité! du! véhicule,! 40! µL! de! volume! «!sonde!»! ou! «!DMSO!»! sont! systématiquement! ajouté! à! chaque! milieu.! Les! cellules! sont! ensuite!incubées!à!37°C!pendant!30!minutes!précises!puis!posées!sur!glace.!Les!cellules!sont!rincées! au!PBS!1X!puis!mises!à!«!sec!»,!congelées!à!=80°C,!et!conservées!plusieurs!jours.!