• Préparation!de!l’échantillon!pour!le!dosage!
Les! cellules! (deux! boîtes! P60)! sont! lavées! avec! du! PBS! 1X! froid.! Puis! les! deux! culots! de! cellules!«!fraîchement!»!grattées!sont!repris!dans!400!µL!de!NADH/NAD!Extraction!Buffer!et!lysés!à! l’aide! de! deux! cycles! «!chaud/froid!»! (un! cycle!:! 20! minutes! sur! de! la! carboglace! –! 10! minutes! à! température! ambiante).! Les! tubes! sont! agités! par! vortex! et! centrifugés! à! 14! 000! rpm! pendant! 5! minutes!puis!les!surnageants!qui!contiennent!le!NADH!et!le!NAD!sont!récupérés.!10!µL!de!la!solution! sont!conservés!pour!le!dosage!de!protéines!par!la!technique!Bradford.!
Optionnel#
! Pour!éliminer!les!enzymes!susceptibles!de!dégrader!le!NADH!pendant!la!durée!du!dosage,!les! surnageants!sont!transférés!dans!des!tubes!avec!une!membrane!de!10kDa!(Microcon,!MRCPRT010,! Millipore)! et! centrifugés! à! 30! 000! g! pendant! 30! minutes! à! 4°C.! Les! échantillons! ainsi! filtrés! ne! contiennent!plus!d’enzymes.!
• Préparation!de!la!gamme!étalon!
La!solution!de!NADH!Standard!est!diluée!au!1/100ème!dans!la!solution!NADH/NAD!Extraction! Buffer!pour!obtenir!10!µM!final.!Deux!gammes,!réalisées!avec!0,!2,!4,!6,!8!et!10!µL!de!la!solution! NADH! Standard! diluée,! sont! déposées! dans! les! puits.! Le! volume! final! est! ajusté! à! 50! µL! avec! la! solution! NADH/NAD! Extraction! Buffer.! Pour! faire! une! estimation! de! la! quantité! de! NADH! dans! les! échantillons,!les!deux!gammes!sont!moyennées.!! • Le!dosage! Chaque!échantillon!est!dosé!en!duplicate!:!40!µL!sont!prélevé!pour!mettre!dans!un!puits!de! microplaque!et!40!µL!de!la!même!préparation!dans!un!deuxième!puits.!Les!échantillons!ainsi!déposés! permettent!de!déterminer!le!taux!de!NAD!total!ou!NADt!(NADH!et!NAD).! Pour!détecter!le!NADH!«!seul!»,!le!NAD!doit!être!décomposé!:!200!µL!de!l’échantillon!extrait! sont!prélevés!et!chauffés!à!60°C!pendant!30!minutes.!Puis,!cet!échantillon!chauffé!est!déposé!dans! les!puits!en!duplicate!également!(40!µL/puits).!
Les!volumes!des!puits!contenant!les!différents!échantillons!sont!ajustés!à!50!µL!final!avec!de! la!solution!NADH/NAD!Extraction!Buffer.! Pour!un!puits,!la!solution!de!NAD!Cycling!Mix!est!préparée!avec!98!µL!de!NAD!Cycling!Buffer! Mix!et!2!µL!de!NAD!Cycling!Enzyme!Mix!et!ajoutée!à!chaque!puits!contenant!les!échantillons!et!les! gammes.!La!microplaque!est!incubée!pendant!5!minutes!à!température!ambiante!pour!convertir!le! NAD!restant!en!NADH.!Puis!10!µL!de!NADH!Developer!sont!ajoutés!à!chaque!puits!pour!enclencher!le! début!de!la!réaction.!La!Do!est!lue!à!450!nm.!Les!données!sont!analysées!pour!présenter!le!taux!de! NADH,!H+!et!de!NAD+!en!µM/mg!de!protéines!ainsi!que!le!rapport!NAD+/NADH,!H+.!Le!taux!de!NAD! est!déterminé!par!la!formule!suivante!:!NAD!=!NADt!–!NADH.!
!
IV. Mesure du lactate extracellulaire, témoin de l’activité
glycolytique
Le! dosage! du! lactate! a! été! réalisé! à! partir! du! surnageant! de! culture! de! cellules! HeLa! transfectées! par! un! siOPA1! ou! un! siContrôle,! à! l’aide! d’un! kit! (Lactate! PAP! 61192,! Biomérieux)! en! suivant! les! recommandations! du! fournisseur.! Les! réactifs! du! kit! contiennent! du! phénol! donc! le! dosage!a!été!effectué!sous!une!hotte!chimique.!
Ensemencement!des!cellules!HeLa!
! Un! million! de! cellules! HeLa! sont! transfectées! par! un! siOPA1! ou! un! siContrôle! puis! ensemencées!dans!une!boîte!10cm!de!diamètre!(P100).!Le!taux!de!lactate!extracellulaire!est!dosé! trois!jours!après!la!transfection.!
Le!dosage!
! 400! µL! du! surnageant! de! culture! sont! dilués! au! 1/10ème! pour! le! dosage.! 10! µL! de! cette! dilution!sont!dosés!avec!990!µL!de!la!solution!R3!(extemporanément,!reprendre!le!tube!noté!R3!avec! 10!mL!de!la!solution!R2)!après!5!minutes!d’incubation!à!température!ambiante.!1!mL!de!la!solution! R3!est!dosé!pour!faire!le!zéro!et!10!µL!de!la!solution!R1!reprise!avec!990!µL!de!la!solution!R3!servent! de!point!de!référence!(3mM!de!lactate).!L’ensemble!des!échantillons!est!dosé!en!duplicat!et!lus,!avec! le!zéro!et!le!point!de!référence,!à!505!nm.!!
Les!cellules!adhérentes!ainsi!que!les!cellules!dans!le!surnageant!de!culture!sont!comptées!à! l’aide!d’une!cellule!de!Malassez.!Les!taux!de!lactate!mesurés!(en!mM)!sont!ensuite!rapportés!pour!un! million!de!cellules.!
!
V. Analyses de molécules antioxydantes : enzymes ou piégeurs
d’EAO
V. 1. Dosage du glutathion réduit et oxydé
Dr!Anne!Galinier,!de!l’équipe!du!Dr!Louis!Casteilla!(StromaLab,!Inserm1031!UMR5273,!CHU! Rangueil,!Toulouse),!a!réalisé!la!mesure!des!formes!réduites!(GSH)!et!oxydées!(GSSG)!du!glutathion.! Le!rapport!des!taux!de!glutathion!réduit!sur!les!taux!de!glutathion!oxydé!participe!à!la!caractérisation! du!statut!redox!de!la!cellule.!!
La! mesure! est! réalisée! par! une! technique! de! chromatographie! différentielle! sur! colonne! (HPLC!sur!le!plasma).!La!phase!mobile!passe!dans!la!colonne!qui!sépare!les!différentes!molécules.!Les! molécules! passent! une! par! une! dans! une! cellule! de! détection! électrochimique,! ce! qui! permet! un! comptage!des!électrons!sur!chaque!molécule!(la!captation!des!électrons!labiles),!qui!dépend!de!l’état! d’oxydo=réduction.!Nous!obtenons!ainsi!une!représentation!de!2!pics!(surface/nombre!d’électrons).! Le!premier!pic!correspond!au!glutathion!réduit!et!le!second!au!glutathion!oxydé.!
Dosage!
Le!dosage!a!été!réalisé!à!partir!de!culots!de!cellules!HeLa!et!de!neurones!transfectés!par!un! siOPA1!ou!un!siContrôle.! Les!culots!secs!de!cellules!sont!déprotéinisés!par!ajout!de!200!µL!d’acide!métaphosphorique! et! agités! par! vortex! pendant! 1! minute.! Les! cellules! sont! centrifugées! pendant! 3! minutes! et! le! surnageant!est!récupéré!pour!le!dosage!du!glutathion.!50!µL!d’eau!stérile!sont!ajoutés!au!surnageant! puis!l’échantillon!est!soniqué!jusqu’à!complète!solubilisation!et!passé!sur!colonne!HPLC.!Le!dosage! de!protéines!est!réalisé!en!parallèle!(avant!la!déprotéinisation).!V. 2. Mesure de l’activité superoxyde dismutase (SOD)
! La!SOD!est!une!enzyme!de!la!machinerie!antioxydante!qui!catalyse!la!dismutation!de!l’anion! superoxyde!avec!l’eau!pour!donner!une!autre!espèce!radicalaire,!le!peroxyde!d’hydrogène.!La!SOD! est!présente!dans!la!cellule!sous!deux!isoformes!:!SOD1!(Cu/Zn=SOD)!qui!est!cytoplasmique!et!dans! l’espace! inter=membranaire! de! la! mitochondrie! et! SOD2! (Mn=SOD)! localisée! dans! la! matrice! mitochondriale.!SOD3!(Cu/Zn=SOD)!est!une!isoforme!extracellulaire.!
! Le! principe! du! dosage! repose! sur! la! propriété! d’auto=oxydation! du! pyrogallol! en! présence! d’EDTA,! réaction! inhibée! par! la! SOD.! Le! dosage! est! basé! sur! la! compétition! entre! la! réaction! d’oxydation!du!pyrogallol!par!les!ROS!et!de!leur!dismutation!par!la!SOD.!Une!unité!enzymatique!est! définie! comme! la! quantité! d’enzyme! capable! d’inhiber! 50! %! de! l’oxydation! du! pyrogallol! dans! les! conditions!de!dosage.!