La synth`ese in situ

La construction des sondes in situ repose sur l’utilisation d’un synth´etiseur automatique d’oligonucl´eotides coupl´e `a la surface de la puce. La synth`ese des sondes peut ˆetre sch´emati- quement d´ecrite comme la condensation d’unit´es nucl´eotidiques prot´eg´ees. Cette r´eaction de condensation fait le plus souvent appel `a des m´ethodes chimiques fond´ees sur l’utilisation du phosphite-phosphoramidite. La puret´e des mol´ecules issues de ces synth`eses est un facteur cl´e. En effet, la qualit´e des r´esultats obtenus lors de l’utilisation d’une biopuce est conditionn´ee par la correspondance exacte qui doit exister entre la s´equence que l’on souhaite fixer en un site et la s´equence effectivement fix´ee. On distingue cependant deux types de puces r´ealis´ees par cette technique : les puces `a faible densit´e de sondes et celles `a haute densit´e.

1.4.1.1 Puces `a haute densit´e

Responsable de la miniaturisation des composants ´electroniques (semi-conducteur), cette technique, d´evelopp´ee par Affymetrix et bas´ee sur la m´ethode VLSIPS & trade (Very Large Scale Immobilised Polymer Synthesis) d´evelopp´ee par Fodor en 1991, permet, en revanche, une pr´ecision extrˆeme dans la fabrication des bio-puces. L’id´ee centrale est la synth`ese combinatoire dirig´ee par la lumi`ere, de formes vari´ees de polym`eres sur une surface (voir figure 1.5).

Apr`es avoir d´epos´e un substrat photosensible sur le verre afin d’activer la surface, on ´eclaire `a travers un masque la puce vierge avec de la lumi`ere ultraviolette. Les zones o`u l’on souhaite d´eposer un nucl´eotide sp´ecifique (par exemple de l’ad´enine) sont transparentes, les autres restant opaques `a la lumi`ere. Les zones ´eclair´ees de la puce sont activ´ees et prˆetes `a recevoir les nucl´eotides car l’illumination conduit `a la d´eprotection des groupes amines expos´es qui sont alors activ´es pour le couplage au premier nucl´eoside modifi´e. La fixation des mol´ecules sur la puce se fait au moyen d’un groupement photolabile (d´ecroch´e par la lumi`ere), que chacune d’elles porte `a son extr´emit´e [7][26]. L’utilisation de masques de formes diff´erentes permet la construction d’oligonucl´eotides de tailles et de s´equences souhait´ees en des sites parfaitement d´efinis.

Un grand degr´e de miniaturisation est possible car la densit´e de la synth`ese n’a qu’une limitation physique quant `a l’accessibilit´e spatiale, ici en l’occurrence la diffraction de la lumi`ere.

17

Il y a donc un abus de langage en pla¸cant la synth`ese in situ dans un paragraphe sur la fixation des sondes, vu que dans ce cas, les sondes sont form´ees base par base.

Fig. 1.5 : Principe de la photolithogravure

Cette m´ethode est pour le moment tr`es on´ereuse. De plus, il est `a noter que l’efficacit´e de synth`ese avoisine 92-94 % `a chaque ´etape de couplage, ce qui peut engendrer un bruit de fond d’autant plus important que l’oligonucl´eotide `a synth´etiser est long et des erreurs de s´equence, ce qui est tr`es probl´ematique pour les puces oligochips et la production de m´esappariement, mismatch. Ensuite, l’empilement d’une base de plus sur toutes les sondes n´ecessite donc quatre passages, au cours desquels on module la forme du masque. Avec ce proc´ed´e, les sondes peuvent comporter jusqu’`a 30 bases. Cette longueur d´epend de la fiabilit´e de la m´ethode. Le rendement effectif de la r´eaction de synth`ese est en effet de l’ordre de 95 %18

. Au-del`a de 30 bases, le risque d’erreur dans la composition des sondes n’assure plus `a la puce une fiabilit´e suffisante. Affymetrix compense ce handicap par une miniaturisation sup´erieure `a celle de ses concurrents, qui lui permet de fixer davantage de sondes plus courtes sur une mˆeme surface (en moyenne 20 bases).

Enfin, les biopuces produites par ce proc´ed´e ne permettent l’hybridation que d’un seul ´echantillon marqu´e `a la fois dans la mesure o`u la m´ethode de d´etection ne permet pas de faire un m´elange de deux marqueurs comme avec les autres puces.

1.4.1.2 Puces `a faible et moyenne densit´e de sondes

La m´ethode d´evelopp´ee par Southern et son ´equipe [27] est bas´ee sur l’utilisation d’un synth´etiseur d’oligonucl´eotides (ABI 381A, Applied Biosystem, Foster City, CA) connect´e `a une cellule de T´eflon o`u se d´eroule la r´eaction ; cette cellule est coupl´ee au support, ici du verre recouvert d’un d´eriv´e d’hexa´ethyl`ene glycol. Ce syst`eme est un syst`eme semi-automatique : l’ABI 381A d´elivre les r´eactifs automatiquement pendant chaque phase de couplage, mais la lame est d´eplac´ee manuellement.

Selon un protocole assez proche, Weiler et al [28] a synth´etis´e 64 oligonucl´eotides sur une membrane de polypropyl`ene. Cette synth`ese fait appel `a une chimie phosphoramidite modifi´ee, permettant `a la fois d’utiliser les oligonucl´eotides comme substrat d’hybridation, mais poss`ede l’avantage de pouvoir ensuite d´etacher les oligonucl´eotides de la membrane (ce qui permet ´eventuellement une analyse ult´erieure des duplex, par exemple par PCR). Ces m´ethodes ne permettent pas la synth`ese de puces `a grandes capacit´es.

18

1.4.1.3 Probl´ematique

Comme pour les microprocesseurs, les puces par photolithogravure sont fabriqu´ees en pa- rall`ele par centaines. L’avantage majeur de cette approche est que le nombre d’oligonucl´eotides qu’il est possible de synth´etiser en mˆeme temps sur la puce est consid´erable. Les puces actuel- lement commercialis´ees par Affymetrix en ont pr`es de 100 000 et les derni`eres, exp´erimentales, en poss`edent plus d’un million. L’inconv´enient est que, si les op´erations de d´eprotection et de couplage ne sont pas parfaites, il y a cr´eation d’oligonucl´eotides n’ayant pas la bonne s´e- quence ou d’oligonucl´eotides branch´es qui introduiront du bruit de fond lors de l’utilisation. Il semble cependant que ce probl`eme soit maintenant bien maˆıtris´e. Un autre inconv´enient de cette approche est que la longueur des ADN qu’il est ainsi possible de synth´etiser est faible. Ainsi, le probl`eme majeur de la synth`ese in situ reste son incapacit´e `a analyser et `a corriger les ´eventuelles erreurs introduites lors de la synth`ese in situ de la surface.

Mais la solution de la synth`ese in situ, de par son principe, ne peut pas actuellement ˆetre am´elior´ee en terme de coˆut ou de rapidit´e, au niveau r´ealisation et analyse de la puce. Notre but ´etant de permettre d’obtenir un outil plus ´evolu´e que ceux disponibles actuellement et `a un coˆut moindre19_{, il ne nous est pas apparu comme un domaine sur lequel nous devions lancer}

notre recherche.

En plus des inconv´enients cit´es pr´ec´edemment, cela reste une solution peu pratique en ce sens qu’il faut tout renouveler (masques, etc...) lorsque l’on souhaite r´ealiser une biopuce diff´erente. Enfin, si les sondes `a r´ealiser sont longues (en termes de nombre de bases les constituant), cette solution devient ´egalement obsol`ete et inadapt´ee.