D´eveloppement de micro-biocapteurs

Matthieu Guirardel d´eveloppe, dans le cadre de sa th`ese au LAAS-CNRS, des membranes pi´ezo´electriques. Ces membranes (voir figure 3.19) qui ressemblent `a des peaux de tambour peuvent au choix ˆetre actionn´ees, afin de provoquer une oscillation, ou servir de capteur au travers de la variation de la valeur de la charge dans la couche pi´ezo´electrique. En effet, un changement des contraintes en surface ou un ajout de masse influence de fa¸con importante la fr´equence de r´esonance d’un tel dispositif. Nous pourrions donc utiliser de tels proc´ed´es afin de d´etecter une hybridation par exemple, lorsqu’il s’agit d’une interaction ADN/ADN, ou toute autre interaction. Ainsi, les marqueurs en fluorescence et les syst`emes pour « scanner » le support ne seraient plus utiles. Ces membranes serviraient `a la fois de support et d’outil analytique pour traiter les donn´ees.

La figure 3.18 d´emontre que le syst`eme que nous avons d´evelopp´e peut d´eposer un produit sur un micro-levier de 50 µm de large, sans d´et´eriorer ni briser celui-ci. Ce micro-levier peut ais´ement ˆetre caract´eris´e — fr´equence de r´esonance, raideur, ... — avant le d´epˆot, apr`es le d´epˆot et apr`es une ´eventuelle r´eaction avec un autre produit. Nous pouvons aussi imaginer de traiter sp´ecifiquement la surface de diff´erents micro-leviers et obtenir ainsi des comportements distincts pour chacun d’entre eux. Les applications sont nombreuses. Des d´epˆots ont ´egalement

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En effet, apr`es 10 d´epˆots environ, il apparaˆıt une homog´en´eit´e acceptable en ce qui concerne la taille des spots.

Fig. 3.17 : Membranes pi´ezo´electriques

Fig. 3.18 : D´epˆots sur des micro-leviers

´et´e r´ealis´es sur ces membranes souples et r´esistantes, tout du moins par rapport `a notre force d’appui.

Il faut savoir que de telles membranes sont plus r´esistantes que de simples micro-leviers. Sur la figure 3.19, nous d´eposons de mani`ere individuelle, c’est-`a-dire sur chaque membrane `a actionnement pi´ezo´electrique. Notons que ces membranes sont des membranes de deuxi`eme g´en´eration par rapport `a celles pr´esent´ees sur la figure 3.17 dans le sens o`u la capacit´e aux plots de contact a ´et´e diminu´ee, permettant ainsi d’am´eliorer les effets inverses (actionnement) et direct (capteur) des membranes. De plus, ce type de microcapteur poss`ede un minimum d´etectable d’environ 100 pg/cm2

[55], ce qui est environ 20 fois sup´erieur aux autres types de capteurs pi´ezo´electriques acoustiques.

3.7

Conclusion

Dans ce troisi`eme chapitre, nous nous sommes attach´es `a pr´esenter l’ensemble des r´esultats permettant de valider notre approche, `a savoir d´emontrer la faisabilit´e de la r´ealisation de biopuces avec un syst`eme utilisant des micro-outils en silicium.

Il a ainsi fallu :

dans un premier temps,

– d´eposer des oligonucl´eotides,

– d´eposer des anticorps (ou prot´eines),

de mani`ere durable tout en maintenant les compos´es d´epos´es actifs ; dans un second temps,

Fig. 3.19 : D´epˆot sur des micro-membranes `a actionnement pi´ezo´electrique

– ´eviter toute contamination, entre des spots adjacents et entre diff´erents produits charg´es dans un mˆeme micro-levier,

– garantir une homog´en´eit´e des spots,

– r´eduire la taille des spots, soit augmenter leur densit´e,

tout cela `a travers un syst`eme moins coˆuteux que les syst`emes de d´epˆot actuels.

Nous avons ´egalement ´etudi´e plus profond´ement le proc´ed´e de d´epˆot lors du contact entre les micro-leviers et le support du d´epˆot. Nous avons confirm´e que le ph´enom`ene de diffusion prend part au d´epˆot, red´emontrant ainsi la n´ecessit´e de contrˆoler le temps de contact lors du d´epˆot (sans parler de la force d’appui). Les param`etres tels que la temp´erature, le taux d’humidit´e jouent un rˆole pr´epond´erant dans la formation du d´epˆot, surtout lorsque l’on r´eduit les ´echelles de travail. Cette influence est ´egalement d’autant plus importante que le temps de contact entre l’outil d´eposant et le substrat est court. Dans notre cas, les conditions am- biantes17

se r´ev`elent ˆetre suffisantes pour garantir un d´epˆot homog`ene, mais un contrˆole plus pr´ecis de ces conditions permettrait sans doute une optimisation.

Tous ces r´esultats justifient notre approche. Il nous est possible de r´ealiser des biopuces (puces `a ADN et/ou puces `a prot´eines) `a haute densit´e, sans d´enaturer les produits d´epos´es et en garantissant une homog´en´eit´e acceptable, permettant de valider les r´esultats..

Une telle compatibilit´e permet d’entrevoir une r´eduction cons´equente des prix de revient des biopuces et ainsi de d´evelopper encore plus cet outil de diagnostic et son emploi.

De plus, plusieurs exp´eriences r´ealis´ees avec notre plate-forme exp´erimentale d´emontrent la compatibilit´e de telles techniques avec les micro- et nano-technologies et permettent d’entrevoir de nouvelles techniques pour la d´etection et l’analyse a posteriori des biopuces.

Nos micro-leviers, principaux outils servant `a la r´ealisation des d´epˆots, ont suivi une ´evo- lution dict´ee par les diff´erents ph´enom`enes observ´es.

C’est ainsi que le chapitre suivant traite de la premi`ere difficult´e rencontr´ee. En effet, la r´eduction des ´echelles de travail entraˆına la pr´epond´erance de certains ph´enom`enes, rendant totalement impossible l’utilisation de nos leviers et leur chargement. Il fallait alors trouver un moyen de modifier les tensions de surface et le caract`ere hydrophile de nos leviers, le tout sans risquer d’alt´erer les propri´et´es chimiques des produits et sondes que nous d´eposions, et ainsi d’optimiser le processus de chargement.

Enfin, nous avons ´egalement constat´e dans ce chapitre l’importance du temps de contact (diffusion), de la force d’appui des leviers sur le support et du ph´enom`ene de glissement que

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cela peut engendrer. Si d’un point de vue fonctionnel, notre syst`eme a ´et´e valid´e, il est possible d’optimiser le processus de d´epˆot. La deuxi`eme partie du chapitre suivant pr´esentera la mise en oeuvre d’un syst`eme de d´etection du contact afin de mettre en place un contrˆole actif du d´epˆot garantissant l’homog´en´eit´e de nos d´epˆots.

3.1 Introduction . . . 60 3.2 Validation de l’utilisation de la table XYZ . . . 60 3.2.1 Validation avec les pointes classiques commerciales . . . 61 3.2.1.1 Protocole exp´erimental . . . 61 3.2.1.2 R´esultats exp´erimentaux . . . 61 3.2.2 Validation avec les micro-leviers d´evelopp´es au LAAS . . . 64 3.3 D´epˆots d’oligonucl´eotides et de prot´eines . . . 66 3.3.1 Puces `a ADN . . . 66 3.3.1.1 Protocole exp´erimental . . . 66 3.3.1.2 R´esultats exp´erimentaux . . . 66 3.3.2 Puces `a prot´eines . . . 67 3.3.2.1 Protocole exp´erimental . . . 67 3.3.2.2 R´esultats exp´erimentaux et discussion . . . 68 3.4 Etude de la diffusion et du temps de contact . . . .´ 69 3.4.1 Protocole exp´erimental . . . 70 3.4.2 R´esultats exp´erimentaux . . . 70 3.4.3 Param`etres influen¸cant le transfert d’un produit . . . 72 3.5 Etude de la « cross-contamination »´ . . . 72 3.5.1 Protocole exp´erimental . . . 73 3.5.2 R´esultats exp´erimentaux . . . 73 3.6 Compatibilit´e avec les micro- et nano-technologies . . . 75 3.6.1 Vers une meilleure r´esolution . . . 75 3.6.1.1 Pr´esentation de la soci´et´e Innopsys . . . 75 3.6.1.2 Exp´erimentation et r´esultats . . . 76 3.6.2 D´eveloppement de micro-biocapteurs . . . 77 3.7 Conclusion . . . 78

4.1

Introduction

Des ´el´ements chimiques ou biochimiques sont utilis´es afin de d´etecter des mol´ecules sp´e- cifiques ou des produits de r´eactions sur tous les laboratoires-sur-puce. Pour que ces ´el´ements remplissent leur fonction, un syst`eme microfluidique est n´ecessaire afin de recevoir ces ´el´e- ments, de les manipuler, de les d´eposer et de distribuer de petits volumes sur la puce, volumes variant de quelques microlitres `a une dizaine de picolitres. Mais ces syst`emes ou ces m´ecanismes servant `a manipuler de si petites quantit´es de produit sont tous ´electrostatiques, i.e. bas´es sur l’´electromouillage, l’´electroconvection, l’´electrophor`ese, l’´electro-osmose et la di´electrophor`ese. Malgr´e des ann´ees d’´etudes de ces ph´enom`enes et de leurs effets, les travaux existant aujourd’hui sont un guide incomplet pour leur exploitation effective dans les applications en microfluidique. Travailler avec des structures inf´erieures `a 100 µm provoque souvent des com- portements inattendus.

Ces changements de comportements peuvent ˆetre attribu´es aux variations importantes des influences relatives des diff´erentes grandeurs en comp´etition (`a savoir la viscosit´e, les tensions de surface, et la capillarit´e). De nombreux param`etres prennent place lors du choix de l’utilisation d’un champ ´electrique pour une application microfluidique, tels que la taille des outils utilis´es, le temps, la temp´erature, etc. ...

Le chapitre pr´ec´edent a d´emontr´e la validit´e de notre approche vis-`a-vis de l’utilisation des micro- et nano-technologies pour la fabrication de biopuces, en s’int´eressant `a tous les aspects biologiques notamment. Mais qui parle de micro- et nano-technologies parle ´egalement d’´echelles micro- et nano-m´etriques et donc de changement de pr´epond´erance entre les forces en pr´esence. Le chargement d’un liquide dans un canal de 5 µm de large n’est pas aussi simple que si le canal fait environ 1 mm de large.

Ce chapitre tente dans un premier temps, de pr´esenter les param`etres prenant part au processus de chargement du produit, en d´efinissant de mani`ere pr´ecise ce qu’est la mouilla- bilit´e.

Une fois ce ph´enom`ene d´efini, nous nous devons d’arriver `a en modifier les deux propri´e- t´es que sont l’angle de contact et la tension de surface, et `a permettre `a nos leviers de se charger. Pour ce faire, plusieurs techniques bas´ees sur l’utilisation de champs ´electriques sont couramment utilis´ees :

– l’´electromouillage, – la di´electrophor`ese, et

– d’autres techniques bas´ees par exemple sur les forces ´electro-statiques ou encore la pho- tosensibilit´e.

L’´electrophor`ese est une technique utilisant ´egalement un champ ´electrique. Elle ne sert pas `a modifier des param`etres tels que l’angle de contact, mais `a quantifier des mol´ecules ou autres particules. Son principe sera donc pr´esent´e rapidement afin de faire le lien avec les autres techniques, et notamment la di´electrophor`ese. Nous dresserons dans un deuxi`eme temps, un bref ´etat de l’art de chacune des techniques, en nous effor¸cant de d´ecrire leurs principes de fonctionnement et surtout sur quels param`etres elles ont une influence.

Puis nous pr´esenterons la solution que nous avons choisie, solution qui nous a amen´es `a ajouter des ´electrodes le long du canal des micro-leviers. Nous justifierons ce choix et mon- trerons ses performances, notamment en nombre de spots d´epos´es avec un seul processus de chargement. Le protocole utilis´e sera d´ecrit en d´etail. Ainsi, le chargement du produit dans les micro-leviers (canal et r´eservoir) sera parfaitement contrˆol´e et facilit´e.

du premier au dernier d´epˆot r´ealis´e, nous ´evitons de r´ealiser des d´epˆots similaires (n d´epˆots similaires = n-uplets) afin d’obtenir un r´esultat moyen sur ces d´epˆots.

Ainsi, dans un deuxi`eme temps, les modifications possibles sur la m´ethode de d´epˆot li´ee aux ´electrodes implant´ees seront ´egalement pr´esent´ees en fin de chapitre. A la fois un contrˆole pr´ecis du d´epˆot via des capteurs de force et une technique de d´epˆot sans contact sont envisageables. Les premiers r´esultats concernant ces ´evolutions concluront ce chapitre.