D´etection et analyse

Apr`es la r´eaction d’interaction, une ´etape de lecture de la puce permet de rep´erer les sondes ayant r´eagi avec l’´echantillon test. Ce rep´erage des hybridations effectives est en quelque sorte une prise d’ « empreintes » qui sera trait´ee par un syst`eme informatique. Elle r´esulte de la mesure des signaux ´emis par les cibles marqu´ees, au moyen de mol´ecules fluorescentes ou radioactives dans la plupart des cas13_{, appari´ees avec les sondes. D’autres m´ethodes de}

d´etection faisant appel `a la luminescence, `a la r´esonance plasmonique de surface ou `a des ph´enom`enes ´electroniques sont aussi envisageables (Cf. section 1.3.3.4).

La lecture est une ´etape cl´e. En effet, sa pr´ecision conditionne de fa¸con majeure la qualit´e des donn´ees trait´ees par le syst`eme informatique et donc la pr´ecision des interpr´etations.

marquage la plus courante. Ses avantages sont nombreux. Elle permet une r´ev´elation directe ou indirecte de l’hybridation et autorise l’utilisation de diff´erents fluorochromes. Des mesures en temps r´eel avec une r´esolution importante peuvent ˆetre effectu´ees (mais cela reste rarement utilis´e par les puces `a ADN ou `a prot´eines). Affymetrix a propos´e un appareil ou scanner con¸cu pour lire ses puces GeneChipT M_{. Il permet de d´etecter les hybridations par un balayage de}

la surface de la puce en microscopie confocale [20]. Apr`es hybridation et lavage, la puce est plac´ee en position retourn´ee dans la cellule de lecture du scanner. Les fluorochromes sont alors excit´es par un laser `a argon, l’´emission de fluorescence est capt´ee par l’objectif du microscope et traverse une s´erie de filtres jusqu’`a un tube photomultiplicateur. Le balayage de l’ensemble de la surface est effectu´e de mani`ere `a collecter le maximum d’informations (de pixels) par site de synth`ese. La r´esolution14

ne cesse de s’am´eliorer, partant d’environ 50 µm pour arriver aujourd’hui au micron. Ce progr`es accompagn´e de l’´evolution du proc´ed´e de lithographie, permet la constitution de puces `a tr`es haute densit´e. L’´equipe de Pat Brown `a Stanford (CA, USA) a publi´e ´egalement plusieurs articles tr`es convaincants sur un tel syst`eme de balayage laser ([10], [21], [22], [23]) et donne sur son site15

des renseignements d´etaill´es. L’approche a ´et´e ´egalement employ´ee par plusieurs groupes industriels, notamment Synteni (entreprise fond´ee par un collaborateur de Pat Brown), et un syst`eme complet a ´et´e commercialis´e par Molecular Dynamics (200 kEuros).

D’autres m´ethodes de d´etection des signaux fluorescents ont ´et´e test´ees : le couplage d’un microscope en ´epifluorescence et d’une cam´era CCD [17], l’utilisation d’un syst`eme de collecte `a fibre optique [15], qui permettent de diminuer notablement les temps de lecture mais s’av`erent moins r´esolutifs. Une autre utilisation des fibres optiques consiste `a greffer des sondes directement sur celles-ci [24] et `a connecter le capteur ainsi form´e `a un syst`eme d’imagerie appropri´e. Apr`es hybridation, les informations sont accessibles soit directement par illumination, soit par rep´erage des diff´erents marquages que l’on peut effectuer. La r´esolution est de 1 sonde par pixel et la lecture d’empreinte d’hybridation est r´ealis´ee en une seconde.

1.3.3.2 L’utilisation du radiomarquage

La d´etection de l’hybridation peut ˆetre ´egalement r´ealis´ee en exploitant le radiomarquage. La m´ethode classique consiste `a effectuer une r´etrotranscription de l’ARN cible, en incorporant un nucl´eotide marqu´e au32<sub>P ou au</sub>33<sub>P. Apr`es hybridation et lavage, l’empreinte d’hybridation</sub>

est saisie par autoradiographie ou au moyen d’un ´ecran accumulateur de phosphore. Le Phos- phorimager (commercialis´e par Molecular Dynamics), permet la digitalisation de l’empreinte

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90 % des puces utilisent la fluorescence, 5 % la radioactivit´e. Ainsi, nos travaux utiliseront la d´etection classique par fluorescence.

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Distance minimale s´eparant deux points perceptibles.

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d’hybridation. Le radiomarquage permet de r´ealiser des mesures d’une grande sensibilit´e. Il souffrait d’une d´efinition beaucoup trop faible, environ 300 µm [25] mais les derniers appareils peuvent atteindre une r´esolution de 5 µm par pixel. Reste le probl`eme de chevauchement des spots dˆu aux ´emissions du phosphore.

1.3.3.3 Autres types de d´etection

D’autres types de d´etection, moins utilis´es, existent ´egalement.

La d´etection enzymatique d’hybridation sur puce est d´eriv´ee du syst`eme de r´ev´elation utilis´e dans certaines techniques de dot-blot inverse (Cf. sch´ema 1.4). Dans ces techniques, l’ADN cible est fix´e sur une membrane et les sondes sont biotinyl´ees. La d´etection est r´ealis´ee par ajout d’un complexe streptadivine-HRP (HorseRadish peroxidase ou Peroxydase de Raifort), l’enzyme permettant l’oxydation d’un chromog`ene. La mesure du signal est r´ealis´ee par colorim´etrie.

Fig. 1.4 : Principe des techniques de dot-blot inverse (A), et d’hybridation sandwich (B). Diff´erentes m´ethodes bas´ees sur l’utilisation de la phosphatase alcaline peuvent servir de base dans le d´eveloppement d’un syst`eme de d´etection. Le point limitant l’utilisation de ce type de proc´ed´e est la n´ecessit´e de compartimenter physiquement les sites contenant les diff´erentes sondes de fa¸con `a empˆecher la diffusion du produit issu de la r´ev´elation enzymatique.

La d´etection ´electrochimique est utilis´ee pour les sondes fix´ees sur des ´electrodes de car- bone. Elle utilise la propri´et´e de certaines mol´ecules `a se r´eduire spontan´ement au contact d’un duplex d’acide nucl´eique. Ainsi, cette mol´ecule lib´eratrice lib`ere un ´electron en s’intercalant

dant inutile l’´etape de marquage des cibles. En effet, l’hybridation de deux mol´ecules d’acides nucl´eiques s’accompagne de variation de propri´et´es physiques qu’il est possible de quantifier dans certaines conditions.

Lorsqu’une structure, constitu´ee d’un semi-conducteur (Si) et recouverte d’un di´electrique (SiO2) o`u sont fix´ees des sondes, est plac´ee dans des conditions de polarisation ad´equates, un courant, sensible aux modifications de charges du semi-conducteur, circule normalement de la source vers le drain. Or, l’hybridation des sondes entraˆıne une modification de la densit´e de charges du semi-conducteur `a l’interface Si/SiO2. Une mesure de la variation de la tension, ´etablie entre la grille et la source afin de maintenir constante la valeur du courant, permet donc de rep´erer les associations sp´ecifiques entre sondes et acides nucl´eiques cibles. Ce syst`eme a ´et´e mis au point `a l’´Ecole centrale de Lyon et se d´enomme GENFET (GEN Field Effect Transistor). De leur cˆot´e, les chercheurs du GenoSensor Consortium et la soci´et´e Beckman Instruments s’int´eressent pour le d´eveloppement de leur puce ´electronique, ou Permittivity ChipsT M_{, `a la}

dispersion di´electrique due aux charges n´egatives des groupements phosphates constitutifs du squelette sucre-phosphate des acides nucl´eiques16

. Ce ph´enom`ene, d´ependant de la longueur de la mol´ecule d’ADN, peut ˆetre quantifi´e par la fr´equence de relaxation de la mol´ecule. Cette grandeur varie, en effet, d’un facteur 100 lorsque la taille de l’ADN varie d’un facteur 10. C’est, par exemple, le cas lorsqu’un fragment simple brin de 100 bases s’hybride avec une sonde 10 mers. En pratique, un analyseur d’imp´edance permet de mesurer l’´energie absorb´ee par les sondes : celle-ci prenant une valeur maximale diff´erente -respectivement 5 et 10 MHz - selon qu’elles sont hybrid´ees ou non, il est possible de r´ep´eter ´electroniquement les hybridations.

Enfin, au LAAS, des membranes et des leviers pi´ezo´electriques ont ´et´e d´evelopp´es et carac- t´eris´es, par des modes de fonctionnement ou des fr´equences de r´esonance. Ainsi une hybridation, perturbant les contraintes en surface de ces capteurs, perturbe les modes de fonctionnement permettant de d´etecter ces hybridations.

Il faut noter que ces travaux concernent la partie d´etection et ne sont pas trait´es dans cette th`ese. Ils sont donn´es ici `a titre d’indications sur les techniques ´emergeant aujourd’hui et concernant les biopuces.

Lors des travaux r´ealis´es et pr´esent´es dans cette th`ese, et qui portent sur la partie d´epˆot des oligonucl´eotides et des prot´eines (voir la section suivante), nous sommes rest´es `a un marquage classique en fluorescence, utilisant `a la fois un ScanArrayerT M _{ou une optique avec microscope}

et des filtres excitant la puce `a certaines longueurs d’onde bien d´etermin´ees, afin de visualiser le marqueur fluorescent utilis´e. Nous avons pu b´en´eficier de deux ScanArrayersT M _{diff´erents, le}

Genepix et le BioAnalyzer, poss´edant deux r´esolutions diff´erentes, qui seront d´ecrits en d´etail ult´erieurement.

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