Maturation, destinée cellulaire des protéines et thérapeutique
I. La NME, une spécificité de substrats très conservée
La NME est un processus qui affecte la majorité des protéines et qui a lieu dès que les premiers résidus de la protéine émergent du tunnel de sortie du ribosome. La NME est la principale voie responsable de la diversité de l’acide aminé N-terminal. Les méthionines initiatrices sont N-formylées chez les eubactéries et dans les organites eucaryotiques et cela empêchent l’action des METAPs [32]. Cependant, le groupement formyle est retiré systématiquement par les peptide déformylases (PDFs). Les PDFs ayant une spécificité de substrats restreinte à la méthionine formylée, il en résulte que virtuellement toutes les protéines seront déformylées ce qui permet l’action des METAPs. Chez les archées [271, 321] et dans le cytoplasme eucaryotique la méthionine initiatrice n’est pas formylée [21], la voie de la NME est donc uniquement assurée par des METAPs. Dans tous les compartiments cellulaires où a lieu la NME c’est donc l’action des METAPs qui détermine la nature du résidu N-terminal. Les METAPs présentent une spécificité de substrats qui a fait l’objet de différentes études par le passé. Néanmoins, le manque d’uniformité des expériences réalisées ainsi que l’apparition de données in vivo de séquences N-terminales ne permettaient pas d’avoir une vision claire de la spécificité de substrats des deux types de METAPs.
1. Spécificité de substrats des METAPs procaryotiques
En utilisant les enzymes purifiées d’E. coli pour la METAP1 et de P. furiosus pour la METAP2 en combinaison avec un ensemble cohérent de peptides substrats, j’ai pu confirmer que la position P1’ (acide aminé suivant la méthionine initiatrice, nomenclature dite de Schechter [83]) est le déterminant majeur du clivage de la méthionine N-terminale. C’est l’encombrement de la chaîne latérale du résidu à cette position qui dicte la spécificité de substrats des METAPs. Les résidus peu encombrants tels que Gly, Ala ou Ser (avec un rayon de giration r<1,30 Å) permettent la réaction tandis que ceux plus imposants à cette position interdisent le clivage (r>1,30 Å). De manière intéressante, en position P1’ les résidus tels que Thr et Val, qui présentent un encombrement stérique moyen (1,20<r<1,30 Å), induisent un clivage peu efficace de la première méthionine [275] (Fig. 50). En outre, j’ai pu montrer que les positions plus en aval de la séquence N-terminale (P2’, P3’, P4’) sont également influentes [275]. L’analyse comparative entre les résultats obtenus pour les deux types de METAPs révèle qu’elles ont une spécificité de substrats très similaire. De plus, l’ensemble de ces données acquis in vitro a été confronté à plus de 800 séquences N-terminales obtenues in vivo chez E. coli. Ces données in vivo sont concordantes avec la spécificité de substrats déduite des études avec les enzymes purifiées [275].
En 2006, 873 peptides N-terminaux avaient été identifiés chez deux archées (H. salinarum et N. pharaonis) [271]. Les résultats que les auteurs ont décrits sont en tous points en accord avec les résultats que j’ai obtenus in vitro. L’absence de méthionine N-terminale a été visualisée pour des protéines ayant en position P1’ les acides aminés Gly, Ala, Pro, Val, Ser et Thr. Peu après, la séquence de plus de 200 peptides N-terminaux provenant d’H. volcanii a été publiée [272] et 70% des séquences identifiées y avaient subi la NME conformément aux « règles » précédemment décrites. Enfin, bien que peu de séquences N-terminales ont été identifiées, il semble que la spécificité de substrats des METAPs soit également conservée chez les archées méthanogènes et celles du genre Sulfolobus [322, 323, 324].
2. La spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques d’A. thaliana
Chez A. thaliana, les METAPs n’ont jamais été purifiées. Durant ma thèse j’ai pu
obtenir des données concernant la spécificité de substrats de la METAP1 cytoplasmique d’A. thaliana. Après expression et purification de cette enzyme à l’aide d’une étiquette streptavidine placée en position N-terminale, j’ai initié l’étude de sa spécificité de substrats. Les résultats que j’ai obtenus concernent uniquement la position P1’ et sont concordants avec l’étude réalisée in vitro avec les METAPs procaryotiques. Néanmoins, d’autres analyses seront requises pour analyser notamment l’influence de la position P2’ sur l’efficacité catalytique du clivage. En outre, il conviendra aussi de purifier et d’analyser la spécificité de substrats des METAP2s d’A. thaliana afin d’avoir une vision juste de la situation dans le cytoplasme de ce modèle eucaryotique et de la contribution respective des deux types de METAPs. Néanmoins, les deux types d’enzymes étant fonctionnellement interchangeables dans le cytoplasme d’A. thaliana [82], on s’attend à ce que les METAP2s présentent une spécificité de substrats similaire ou peu différente de celle de la METAP1. En outre, 42 séquences de peptides N-terminaux ont été obtenues chez A. thaliana [1]. Cet ensemble se caractérise par un profil d’excision de la méthionine N-terminale conforme à la spécificité de substrats des METAPs décrite jusqu’à présent. Plus de 100 séquences N-terminales uniques d’A. thaliana provenant de fraction protéiques membranaires et solubles ont été obtenues et montrent également un clivage principalement dépendant de l’encombrement de la chaîne latérale du résidu en position P1’ suivant les règles déduites des analyses précédentes [263].
3. Le cas de la spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques chez
l’Homme
En 2010, la spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques humaines et de la METAP d’E. coli purifiées a été étudiée en utilisant des séries combinatoires de peptides. Les données rapportées par les auteurs sont très similaires aux résultats que j’ai moi-même obtenus. En effet, pour l’enzyme d’E. coli les auteurs rapportent que les acides aminés Ala, Gly, Cys, Pro et Ser en position P1’ permettent un clivage complet de la méthionine N-terminale hormis lorsqu’une Pro est en position P2’. Lorsqu’ un résidu Thr ou Val se trouve en position P1’ en l’absence de Pro en P2’ l’efficacité du clivage est variable et dépend d’autres éléments tels que la nature des acides aminés aux positions P2’, P3’, P4’ et P5’, le niveau d’expression des protéines et les conditions de croissance. Toute combinaison alternative ne permet pas le clivage de la méthionine initiatrice [325]. Ainsi ces résultats sont
concordants avec ceux que j’ai obtenus. L’utilisation des enzymes purifiées humaines a permis aux auteurs américains de suggérer que chez les mammifères, les protéines ayant une Ala, Cys, Gly, Pro et Ser en P1’ subissent le clivage complet de la méthionine initiatrice et réalisé par les deux types de METAPs. Les résidus Val et Thr en position P1’ engendrent un clivage peu efficace de la méthionine initiatrice et est catalysé principalement par la METAP2 et dépend aussi des résidus suivants. Ainsi, la présence de résidus Asp, Glu ou Pro en position P2’ induit un clivage incomplet ou une absence de clivage de la première méthionine. Ces résultats montrent encore une fois une très grande conservation de la spécificité de substrats des METAPs à travers le vivant. De même, comme pour les formes procaryotiques, les deux types de METAPs humaines démontrent une spécificité de substrats très similaire. Néanmoins, une différence de spécificité de substrats entre les deux enzymes humaines a été découverte. En effet, les substrats ayant une Val ou une Thr en P1’ sont principalement clivés par la METAP2. De même, pour appuyer ces données, la majorité des substrats spécifiques des METAP2s identifiés in vivo sont des protéines ayant une Val en position P1’ ([325] et référence citées dedans). Ces résultats peuvent être expliqués par la taille de la poche S1’ du site actif de la METAP1 par rapport à celle de la METAP2 [41].
Met-P1’-P2’-P3’...
Action des METAPs en fonction du résidu P1’
Met-P1’-P2’-P3’... P1’-P2’-P3’...
Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Trp,
Tyr
Action des Nats en fonction des résidus N-terminaux
Ala, Gly, Ser, Pro, Cys
Val, Thr
Dépend des résidus P2’, P3’, P4’ et des conditions cellulaires archées eubactéries eucaryotes Ac-Met-P1’-P2’-P3’... Ac-Met-Gln Ac-Met-Asp Ac-Met-Glu Ac-Met-Asn Ac-Met-Ile Ac-Met-Leu Ac-Met-Phe Ac-Met-Trp NatB NatC eucaryotes Ac-Ser Ac-Ala# Ac-Ser Ac-Ala Ac-Gly Ac-Thr Ac-Cys Ac-Val NatA NatA-like Ac-P1’-P2’-P3’... R>1,30 R<1,30 archées eubactéries eucaryotes archées eubactéries eucaryotes
Clivée principalement par METAP2 chez l’Homme
1,20<R<1,30
archées eucaryotes
Figure 50. Spécificité de substrats de la NME et de la N-α-acétylation
Le déterminant majeur de la spécificité de substrats des METAPs est l’encombrement de la chaîne latérale du résidu en position P1’ (nomenclature de Schechter [Erreur ! Source du renvoi introuvable.]) et cela est conservé à travers le vivant ainsi qu’entre les deux types de METAPs. En rouge, les résidus ne permettant pas à cette position un clivage de la méthionine N-terminale, en vert ceux le permettant et en orange les résidus induisant un clivage peu efficace de la méthionine initiatrice et dépendant d’autres facteurs. L’N-α-acétylation a lieu chez les archées et dans le cytoplasme eucaryotique. La N-α-acétylation est exceptionnelle chez les eubactéries. Différentes Nats existent chez les eucaryotes et ont une spécificité de substrats différente. Chez les archées, il existe une Nat de type NatA. R ; rayon de giration de la chaîne latérale (Å) ; les acides aminés sont notés en utilisant le code à trois lettres. # signifie que l’acétylation de l’Ala est partielle chez les archées
E ! S d i i t bl
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