A.1. HUVECs, modèles d’étude des lignées endothéliales
La littérature est relativement abondante concernant les inhibiteurs des METAP2s et leurs effets sur différentes lignées cellulaires normales et pathologiques de mammifères. Néanmoins, il reste difficile d’avoir une vision claire de l’effet de ces inhibiteurs sur des cellules de mammifères. Cela est principalement dû au manque d’uniformité des différentes expériences. Par exemple, il existe de nombreuses lignées cellulaires qui peuvent être cultivées dans au moins autant de différentes conditions. De plus, différents inhibiteurs peuvent être utilisés (voir Introduction).
Les HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sont néanmoins reconnue pour être très sensibles aux inhibiteurs des METAP2s. Il s’agit d’une lignée de cellules primaires endothéliales. Nous avons donc décidé d’utiliser principalement cette lignée. J’ai utilisé deux méthodes différentes mais complémentaires pour visualiser la prolifération cellulaire pour différentes conditions de traitement des cellules avec la fumagilline. Une méthode de comptage cellulaire directe et précise mais ne permettant pas de faire des analyses à grande échelle et nécessitant beaucoup de cellules. La deuxième méthode est une mesure indirecte de la prolifération cellulaire mais permet par exemple l’utilisation de microplaques de 96 puits et donc peu de cellules consommées. Cette méthode indirecte très utilisée est réalisée avec le CellTiter-blue (Promega). Concrètement, les cultures cellulaires sont mises en présence de résazurine qui sera réduite en un composé fluorescent, la résorufine par les cellules vivantes.
L’application de fumagilline dans le milieu de culture de ces cellules inhibe leur prolifération (Fig. 38), en accord avec les résultats déjà rapportés dans la littérature [95]. La visualisation de la prolifération cellulaire réalisée avec le CellTiter-blue et en microplaque de 96 puits montre une réduction d’environ 40 % de la prolifération cellulaire lorsque les cellules sont mises en présence de 1 nM de fumagilline et après 72h d’incubations (Fig. 38). Les concentrations supérieures en fumagilline ne semblent pas réduire davantage la prolifération cellulaire. Ces données confirment également l’effet cytostatique de la fumagilline sur les HUVECs puisque la quantité de cellules ne diminue pas en deçà de la quantité de cellules
inoculées à l’origine (Fig. 38). Lorsque l’on réalise cette expérience en plaque de 24 puits et en comptant directement le nombre de cellules après 72 d’incubation avec la fumagilline, nous observons une réduction de la prolifération allant jusqu'à 60% pour des concentrations en fumagilline de l’ordre du nanomolaire (Fig. 38). Cette différence peut s’expliquer par le fait que la mesure de la prolifération cellulaire avec le CellTiter-blue est indirecte et qu’il est donc très probable qu’un biais existe à ce niveau. Néanmoins, dans nos conditions expérimentales, la fumagilline inhibe de 50 % la prolifération des HUVECs de façon cytostatique pour des concentrations en inhibiteur de l’ordre du nanomolaire. Une concentration en fumagilline de 5 nM sera désormais utilisée pour traiter les HUVECs et constituera mon modèle d’étude de la NME cytoplasmique chez les HUVECs.
Fumagilline [nM] 0 0,001 0,01 0,1 0,5 1 5 10 50 100 500 1000 10000 0 20 40 60 80 100 120 Prolifération cell ulaire (% du con trôle) Fumagilline [nM] 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0,5 1 5 10 100 1000 10000 Nombre de cellul es (X 10 6)
Figure 38 – Prolifération des cellules HUVECs en présence de fumagilline.
Les cellules de la lignée HUVEC ont été cultivées en présence de différentes concentrations en fumagilline. Après 72 h d’incubation avec la drogue, la prolifération cellulaire est mesurée à l’aide du CellTiter-blue (graphique de gauche) ou en comptage directe (graphique de droite). La ligne orange montre la quantité de cellules inoculées (0,028.106). L’incertitude représente l’erreur standard de la mesure.
De manière surprenante, la lignée cellulaire endothéliale EA.hy926, une lignée dérivée de la lignée HUVEC, est beaucoup moins sensible à la fumagilline (Fig. 39). L’ajout de 10 µM de fumagilline dans le milieu de culture ne provoque que 40% de réduction de leur prolifération (Fig. 39). Ce résultat est intéressant car ces cellules partagent à cause de leur origine beaucoup de point commun avec les HUVECs qui elles sont hypersensibles à la fumagilline. Par conséquent, c’est dans le peu de différences entre ces deux lignées qu’il y a le ou les responsables de cette sensibilité différentielle à la fumagilline. Toutefois, il faut remarquer que les milieux de cultures utilisées pour ces deux lignées sont différents et que leur composition exacte n’est pas connue. Il faudrait parvenir à cultiver ces deux lignées dans les mêmes conditions pour établir si les différences sont associées ou non au milieu du
culture. Fumagilline [µM] 0 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1 5 10 0 20 40 60 80 100
Figure 39 – Prolifération des cellules EA.hy926s en présence de fumagilline.
Les cellules de la lignée EA.hy926 ont été cultivées en présence de différentes concentrations en fumagilline. Après 72 h d’incubation avec la drogue, la prolifération cellulaire est mesurée à l’aide du CellTiter-blue. L’incertitude représente l’erreur standard de la mesure.
Prolifération
cell
ulaire (%
du con
trôle)
A.2. HCT-116, modèle d’étude de lignées tumorales
J’ai également testé la réponse d’autres lignées cellulaires à la fumagilline car la littérature rapporte un effet antiprolifératif ou non selon le type cellulaire utilisé. La lignée cellulaire HCT-116 est une lignée tumorale de cancer du colon bien différenciée. Les tests de prolifération de cette lignée en présence de fumagilline réalisés avec le CellTiter-blue et en comptage direct montrent que cette lignée est de trois ordres de grandeur moins sensible à la fumagilline que les HUVECs (Fig. 40A). En effet, il faut 1 µM d’inhibiteur pour diminuer au maximum de 50 % la prolifération cellulaire (Fig. 40A).
Il a été rapporté durant les essais cliniques que les composées de la classe de la fumagilline, exemplifié par le TNP-470 présentent une demi-vie dans le plasma sanguin très faible (environ 7 min). Parmi les hypothèses, il a été suggéré que la fumagilline soit dégradée/métabolisée par des époxydes hydrolases [317, 318]. J’ai alors décidé de caractériser et comparer après 72h de culture l’effet sur la lignée HCT-116 de l’application d’une seule dose initiale de fumagilline et l’effet obtenu quand les applications de fumagilline sont répétées plusieurs fois pendant les 72h. Cela représente l’ajout de 3 doses de fumagilline durant les 72h d’incubations (traitement à 0 h, 24 h et 48 h). Avec ce type d’expérience, je m’attendais à observer des effets drastiques avec les applications répétées de fumagilline si
une dégradation rapide de la fumagilline avait lieu pendant les 72h. Pourtant, la comparaison de la prolifération des cellules traitées de cette façon avec celle des cellules ayant été traitées une seule fois ne montre pas d’importantes différences (Fig. 40B). Le triple traitement diminue de 10 % la prolifération cellulaire par rapport au simple traitement. Dans toutes ces conditions, l’efficacité de la fumagilline sur la lignée HCT-116 reste faible par rapport à celle constatée sur les HUVECs. Par conséquent, ces résultats suggèrent que la demi-vie de la fumagilline dans nos conditions n’est pas la cause de sa faible efficacité à inhiber la prolifération cellulaire de cellules HCT-116.
Une concentration en fumagilline de 1 µM sera désormais utilisée pour traiter les cellules de la lignée HCT-116 et constituera mon modèle d’étude de la NME cytoplasmique chez ces cellules.
Fumagilline [µM] 0 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Prolifération cell ulaire (% du con trôle) 0 20 40 60 80 100
A B
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 1 10 102 103 104 fum 1X fum 3X Fumagilline [nM] Nombre de cellul es (X 10 6)Figure 40 – Prolifération des cellules de la lignée HCT-116 en présence de fumagilline.
Les cellules de la lignée HCT-116 ont été cultivées en présence de différentes concentrations en fumagilline.
A. Après 72h d’incubation avec la drogue, la prolifération cellulaire est mesuré à l’aide du CellTiter-blue. B.
Les cellules de la lignée HCT-116 ont également été mises en présence de fumagilline ajoutée chaque jour (0h, 24h, 48h ; fum 3X) ou uniquement un traitement à 0h (fum 1X) et un comptage direct à été réalisé à 72h. La ligne orange montre le nombre de cellules inoculées (0,014.106). L’incertitude représente l’erreur standard de la mesure.
B. L’expression des METAPs chez les HUVECs et les cellules de la lignée