L’opérationnalisation de l’approche de Sen

Cupriavidus necator (anteriormente conhecida como

Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha

e Wautersia eutropha (VANDAMME; COENYE, 2004)) é um microrganismo Gram negativo que se apresenta na forma de bastonete de 0,5 por 1,8 a 2,6 µm (DAVIS; DOUDOROFF; STANIER, 1969).

Esse microrganismo é um dos que apresenta condições favoráveis à produção industrial de PHAs, por ser capaz de acumular até 80 % de sua massa seca em biopolímero, além de, utilizar diferentes tipos de substratos, como glicose, frutose, óleos vegetais e ácidos orgânicos (CHAKRABORTY; GIBBONS; MUTHUKUMARAPPAN, 2009; KAHAR et al., 2004; RAMSAY, 1994). A síntese do polímero ocorre em duas etapas: na primeira, procura-se favorecer ao máximo o crescimento celular com todos os nutrientes presentes no meio em concentrações adequadas, na segunda etapa interrompe-se o crescimento celular, através da limitação de um nutriente não fonte de carbono, estimulando o acúmulo de polímero nas células (GOMES; BUENO NETO, 1997). Esta bactéria é naturalmente capaz de acumular apenas scl-PHA, entre eles, Poli(3-hidroxibutirato), Poli(3-hidroxivalerato), Poli(4-hidroxibutirato) e seus copolímeros, conforme o substrato fornecido como fonte de carbono (LEE, 1996a). Para que outros PHAs sejam produzidos por C. necator, a aplicação da engenharia metabólica é necessária, como no caso da produção de P(3HB-co-3HHx) reportada por Budde et al. (2011).

Neste trabalho, será avaliada de forma mais aprofundada a utilização de glicose e ácido propiônico como fontes de carbono para produção de P(3HB) e de P(3HB-co-3HV). Portanto nesta revisão serão detalhados apenas o metabolismo de assimilação dos carboidratos e deste ácido orgânico, a cadeia respiratória, a biossíntese e a degradação destes biopolímeros.

2.2.1.1 Metabolismo dos carboidratos

Cepas selvagens de Cupriavidus necator são capazes de assimilar frutose pela via de Entner-Doudoroff, porém não são capazes de assimilar a glicose (GOTTSCHALK; EBERHARDT; SCHLEGEL, 1964). Apesar da cepa possuir as enzimas necessárias para metabolizar a

glicose em seu citoplasma, acredita-se que não exista um mecanismo natural de permeação da glicose através da parede celular (RABERG et al., 2011).

A cepa C. necator DSM 545 é uma mutante natural capaz de utilizar a glicose como fonte de carbono e, de acordo com o estudo realizado por Raberg e colaboradores (2011), a mutação possivelmente ocorreu na etapa de permeação da glicose pela parede celular. De acordo com estes autores, para que a glicose possa ser transportada para o interior da célula, há uma superexpressão das proteínas NagE, NagF e NagC, que fazem parte do sistema de transporte fosfotransferase N- acetilglicosamina específico (tipo PTS ).

Orita e colaboradores (2012) estudaram a assimilação da glicose por cepas geneticamente modificadas e afirmam que, além do fato das cepas selvagens não possuírem o sistema de transporte da glicose, existe uma deficiência na etapa de fosforilação da glicose após sua permeação e, portanto, modificações também ocorrem nesta etapa do metabolismo.

Um esquema do catabolismo dos carboidratos em Cupriavidus

necator, levando-se em consideração a permeação da glicose, baseada

nos estudos de Raberg e colaboradores (2011) está apresentado na Figura 2.2.

Figura 2.2: Catabolismo dos carboidratos em C. necator - Em cinza a via

Entner-Doudoroff e suas enzimas: EDD, gliconato-6-fosfato desidratase; EDA, 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato aldolase; (*) a existência desta via ainda não foi comprovada (GND, gliconato-6P-desidrogenase); Nomenclatura das demais enzimas em cinza: HK, hexoquinase; GK, hexoquinase; PGI, fosfoglicose isomerase; G6PD, glicose-6-fosfato desidrogenase; FBPA, frutose bifosfato aldolase; FBPP, frutose bifosfato fosfatase; G3PD, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; PGK, fosfoglicerato quinase; PGM, fosfoglicerato mutase; ENO, enolase; PK, piruvato quinase; PDH, piruvato desidrogenase; abreviação PPP para a via das pentoses fosfato, TCA para via do ácido cítrico e PTS para o sistema de transporte da fosfotransferase; NagC, proteína da membrana externa (porina), NagE, proteína do sistema açúcar fosfotransferase (presente na membrana), NagF, proteína do sistema açúcar fosfotransferase (presente no citosol).

Fonte: Adaptado de Grousseau (2012). Frutose Glicose NagC NagE Glicose-6P ATP ADP Frutose-6P ATP ADP Frutose-1,6P ATP ADP Gliceraldeído-3P Glicerato-1,3P Glicerato-3P Glicerato-2P Fosfoenolpiruvato (PEP) Piruvato ADP ATP ADP ATP 2NAD 2NADH 2Pi Acetil-CoA NAD NADH CoA-SH CO2 PHA TCA HK GK PGI FBPP FBPA G3PD PGK PGM ENO PK PDH

Gliconato-6P _{desoxigliconato-6P}2-ceto-3- NADP NADPH H2O H2O PPP NADP NADPH CO2 * Via de Entner-Doudoroff G6PD GND EDA EIIA-P EIIA HPr HPr-P El-P El Pyr PEP ATP AMP + Pi PTS NagF EDD

2.2.1.2 Metabolismo do ácido propiônico

O ácido propiônico, quando adicionado na fase de produção, é utilizado como substrato para produção do copolímero P(3HB-co-3HV). A cepa também é capaz de consumir este substrato, quando presente na fase de crescimento a partir de três diferentes tipos de ativação da molécula de ácido propiônico:

1) Ácido Propiônico + Acetil-CoA → Propionil-CoA + Acetato 2) Ácido Propiônico + CoA + ATP → Propionil-CoA + AMP + PPi 3) Ácido Propiônico + ATP → Propionil-P + ADP

Propionil-P + CoA → Propionil-CoA + Pi

Após passar pela ativação, a assimilação do propionil-CoA pode ocorrer por três vias diferentes: β-oxidação, ciclo do metil-citrato (BRAMER; STEINBUCHEL, 2001) ou via do succinil-CoA. Apesar do propionil-CoA poder ser assimilado pela via do Succinil-CoA, a enzima metilmalonil-CoA epimerase, responsável pela conversão do S- metilmalonil-CoA em R-metilmalonil-CoA não foi identificada em cepas de Cupriavidus necator (KEGG PATHWAY – propanoate metabolism (2015). Da mesma forma, duas enzimas da via da β- oxidação (Figura 2.3) não foram identificadas em C. necator. Logo, não é possível afirmar que estas rotas são possíveis para esta cepa, e serão desconsideradas.

Figura 2.3: Assimilação do Propionil-CoA pela β–oxidação. As enzimas

envolvidas na reação são acil-CoA desidrogenase (1), enoil-CoA hidratase (2), 3-hidroxibutiril-CoA hidrolase (3), 3-hidroxipropanoato desidrogenase (4) e metilmalonato semialdeído desidrogenase (5). As enzimas 3 e 4 não foram identificadas para C. necator.

Fonte: KEGG PATHWAY – propanoate metabolism (2015).

Ciclo do metil-citrato: A partir desta via, o propionil-CoA é convertido a piruvato que, via gliconeogênese, alimenta a célula em precursores. O balanço global para a assimilação do ácido propiônico por esta via fica:

Propionil-CoA + FAD + 2 H2O + 2 NAD → Acetil-CoA + FADH + 2 NADH + CO2

Acriloil- CoA Propionil- CoA FAD FADH 3-hidroxipropanoil- CoA H2O H2O CoA (S)-3-hidroxi(2)- metilpropanoato Malonato semialdeído NAD NADH Acetil-CoA CoA CO2 NAD NADH 1 2 3 4 5

As rotas metabólicas envolvidas podem ser observadas na Figura 2.4. Após ativado, o propionil-CoA também pode ser utilizado diretamente na produção das unidades de 3HV, como será apresentado mais adiante.

Figura 2.4: Esquema da via de assimilação do ácido propiônico em C. necator

(considerando apenas o ciclo do metil citrato). Em cinza as enzimas envolvidas nas diferentes vias, sendo: PK, piruvato quinase e PDH, piruvato desidrogenase. Abreviação MCC para a via do ciclo do metil-citrato e TCA para via do ciclo do ácido cítrico.

Fonte: Adaptado de Grousseau (2012); Bramer; Steinbüchel, 2001 e Lehninger; Nelson; Cox (2008).

2.2.1.3 Cadeia de transporte de elétrons – fosforilação oxidativa

Na fosforilação oxidativa (Figura 2.5), cinco complexos enzimáticos estão envolvidos na produção de ATP. O Complexo I, também conhecido como NADH desidrogenase, transfere os elétrons fornecidos pelo NADH para a ubiquinona, formando o ubiquinol, que se difunde pela membrana interna até o Complexo III, em que voltará a ser oxidado a ubiquinona. No Complexo II, também conhecido como succinato desidrogenase, os elétrons do succinato são transferidos para a ubiquinona, formando o ubiquinol, que também será posteriormente oxidado a ubiquinona no Complexo III. O Complexo III, ou complexo

Gliconeogênese PEP Piruvato ADP PK ATP NAD NADH CoASH CO2 PDH Acetil-CoA Oxaloacetato Citrato CoASH Citrato sintase H2O Cis-aconitase Aconitase Isocitrato α-cetoglutarato Aconitase NAD(P) NAD(P)H α-cetoglutarato desidrogenase CO2 Succinil-CoA Succinato Isocitrato desidrogenase NAD NADH CoASH CO2 ATP ADP + Pi CoASH Succinil-CoA sintase Fumarato Malato H2O Fumarase FAD FADH Succinato desidrogenase NAD NADH Malato desidrogenase H2O Metil citrato TCA Metilaconitato Metilisocitrato Propionil-CoA CoASH Metilcitrato sintase H2O H2O Metilcitrato desidratase Metil cis-aconitato hidratase MCC Metilcitrato liase

citocromo bc1, acopla a transferência de elétrons do ubiquinol para o citocromo c (Complexo IV), que transporta dois elétrons para o oxigênio molecular, reduzindo-o a H2O (LEHNINGER et al., 2008).

Aproximadamente 200 kJ de energia são liberados pela oxidação de 1 mol de NADH, que são conservados no gradiente de prótons. Quando os prótons deslocam-se espontaneamente, a energia é disponibilizada para produzir trabalho. Esta energia eletroquímica direciona a síntese de ATP a partir de ADP e Pi (fósforo inorgânico) através da ATP sintase, ou Complexo V (LEHNINGER et al., 2008).

Figura 2.5: Esquema da cadeia respiratória em Cupriavidus necator.

Fonte: Adaptado de KEGG PATHWAY – oxidative phosphorylation (2015) e Lehninger et al., 2008.

As concentrações relativas de ATP e ADP controlam não só a transferência de elétrons, como também a fosforilação oxidativa e as velocidades do TCA, a oxidação do piruvato e a glicólise. Sempre que o consumo de ATP aumenta, a velocidade de transferência de elétrons e da fosforilação oxidativa aumenta. Simultaneamente, a velocidade da oxidação do piruvato via TCA aumenta, elevando desta forma o fluxo de elétrons da cadeia respiratória. Esses eventos podem, por sua vez, provocar um aumento na velocidade da glicólise, aumentando a velocidade de formação de piruvato. Quando a conversão de ADP em ATP diminui a concentração do ADP, o controle aceptor diminui a transferência de elétrons e, portanto, a fosforilação oxidativa. A glicólise e o TCA também diminuem, uma vez que o ATP é um inibidor alostérico da piruvato desidrogenase (LEHNINGER et al., 2008).

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