5.3 Contraction droite d’un canal simple
6.1.4 L’objectif de microscope
Une fois les aberrations causées par l’interface du filament rendues négligeables il faut déterminer quel objectif de microscope utiliser. C’est là encore un problème
d’optimisation aboutissant à un compromis.
Les objectifs utilisables avec notre microscope sont du type « corrigé à l’in- fini ». Dans cette configuration l’objet est au point focal de l’objectif et son image est à l’infini. Elle est projetée sur le détecteur (la caméra) par une « lentille de tube »n’introduisant pas d’aberration supplémentaire et ne diaphragmant pas le faisceau issu de l’objectif. Le grandissement G n’est pas une caractéristique de l’objectif mais est donné par le rapport des longueurs focales de l’objectif et de la lentille de tube (pour le microscope Leica utilisé ici c’est 200 mm). Pour exploi- ter au mieux la résolution de la caméra (pixels ≈ 23 µm) le grossissement total doit être compris entre x60 et x100, sachant que le microscope possède une lentille d’apppoint x1,6.
Il faut rechercher un objectif à grande ouverture numérique ON = n sin α afin de maximiser l’intensité lumineuse captée (n est l’indice du milieu d’immersion et α est le demi-angle du plus grand cône de lumière utile ). Elle détermine la proportion Γ de photons de fluorescence (émis de façon incohérente et isotrope) collectés selon l’expression :
Γ = 1 − cos α 2 = 1 − r 1 −ONn 2 2 (6.1)
L’image d’une source ponctuelle (un fluorophore émettant de manière incohé- rente) au foyer objet d’un objectif parfait est la figure de diffraction de Fraunhofer. La tâche centrale de rayon
dr =
0, 61λ
ON (6.2)
comprend 84 % de l’énergie dans le plan de l’image du point. Cette distance cor-
respond à la distance minimum du critère de résolution d’Airy entre deux points5.
De même la distribution axiale de l’intensité définit la profondeur de champ (du côté objet) :
2dz =
2λn
ON2 (6.3)
Une grande ouverture numérique est intéressante car elle augmente la résolu- tion latérale et axiale. Ce dernier point permet notamment d’augmenter le rapport signal sur bruit en diminuant la contribution des sources situées en dehors du plan focal. La majeure partie de l’énergie lumineuse émise par un point source est comprise dans un cercle d’aire proportionnelle au carré du rapport ouverture nu- mérique sur grandissement. L’image du point source par un objectif sera d’autant
plus intense que la quantitéONG 2sera élevée. Il faut effectuer un compromis entre
agrandissement et ouverture numérique afin d’optimiser le signal. Pour cela on dé- termine le grandissement maximal utile en fonction du détecteur et on maximise l’ouverture numérique.
5En éclairage cohérent ce critère devient d = 0, 82λ/ON .
L’efficacité lumineuse totale d’un objectif parfait est donc donnée par le pro- duit : Γ ON G 2 (6.4)
dont une valeur approchée à 10 % est ON4/(2nG)2.
L’objectif utilisé en épifluorescence joue aussi le rôle de condenseur. Dans notre cas on met en forme le faisceau laser pour que le champ illuminé soit plus petit que le champ de vision de l’objectif. L’intensité d’excitation est donc multipliée
par le facteur G2, mais le signal réémis par les fluorophores peut saturer.
Il faut aussi rechercher un objectif avec une grande distance de travail Wd (de
l’ordre du millimètre) afin que la présence d’une paroi n’influence pas la dynamique de rupture du filament. Or qu’il s’agisse des objectifs à air ou à immersion une grande ouverture implique généralement une petite distance de travail et récipro- quement (voir le tableau 6.3).
x G ON Wd n Inorm dr dz ∞ (mm) % (µm) (µm) 5 0,12 10 1 1 2,80 57,1 10 0,25 5,8 1 5 1,34 17,6 20 0,4 0-2 1 8 0,83 6,9 40 0,55 0-2 1 7 0,61 3,6 40 0,8 3,3 1,33 30 0,42 2,3 63 0,7 1,1-1,3 1 7 0,48 2,2 63 0,9 2,2 1,33 19 0,37 1,8 63 1,4 0,1 1,52 100 0,24 0,9 100 1,25 0,12 1,52 26 0,27 1,0
Tab. 6.3 – Quelques objectifs Leica et leurs caractéristiques. La colonne Inorm
représente l’intensité collectée en épifluorescence normalisée par celle de l’objectif de plus grande ouverture numérique.
Les plus grandes distances de travail sont souvent obtenues avec les objectifs secs. Mais un objectif à air est ici exlu à cause de la trop grande différence d’indice entre le milieu d’immersion et l’air (∆n ≈ 0, 47 !) et de l’épaisseur de cette région (quelques mm). Les objectifs de grande ouverture (ON > 0, 5) sont très sensibles
aux inhomogénéités d’indice6. Par exemple le x63/0,7 Fluotar de Leica a une dis-
tance de travail de 2,6-1,8 mm et une bague de correction qui permet d’utiliser des lamelles de 0,1 à 1,1 mm d’épaisseur en verre (n = 1,518). Mais même pour ce dernier en utilisant une lamelle de quelques microns, alors qu’il offre un des
6Au point que certains objectifs secs sont équipés d’une bague de correction afin de corriger
les aberrations causées par des variations de l’épaisseur des lamelles de l’ordre de la dizaine de microns.
meilleurs compromis ouverture/distance, une épaisseur de 3 mm à n = 1,47 est rédhibitoire.
Les objectifs à immersion dans l’huile (∆n ≈ 0, 05) ou dans le glycérol (∆n ≈ 0, 01) ont des distances de travail typiquement inférieures à 200 µm. Je n’ai trouvé
aucun objectif de ces types 7 avec une distance de travail suffisante (ne serait-
ce qu’un millimètre) parmi les constructeurs suivants : Lomo, Nachet, Mitutoyo, Leica, Zeiss, Olympus et Nikon.
Il existe des objectifs à immersion dans l’eau (on a alors ∆n ≈ 0, 17) qui sont plongés directement dans le milieu étudié, sans lamelle. Ils sont conçus pour permettre un accés aisé à l’échantillon étudié, notamment en électrophysiologie. Leur distance de travail est millimétrique, mais leur ouverture numérique est plus modeste (≤ 0, 9) comparé à un objectif à eau typique (ON ≈ 1, 2 et distance de travail de 100 µm).
Leica propose ces deux objectifs à immersion directe dans l’eau : un x40/0,8 et un x63/0,9 (modèles HCX APO L UVI) avec respectivement une distance de travail de 3,3 mm et 2,2 mm, une efficacité de 30 et 20 % et des résolutions similaires (tab. 6.3). L’objectif X40 est donc le meilleur compromis distance de travail/ouverture numérique grâce à ses 3,3 mm et une ouverture raisonnable. C’est donc l’objectif que je choisis initialement pour tester le montage.