III Etude du mécanisme de traduction des ARNm de sélénoprotéines
III.2.2 Vers lidentification de nouveaux facteurs des complexes de traduction des ARNm de sélénoprotéines
GTPase différente de celles impliquées dans le processus dinitiation canonique. Nous avons montré que la région 3UTR est essentielle au recrutement des ribosomes sur lARNm de SelM. Par ailleurs, nous avons identifié un site de liaison de SBP2 dans la phase codante de lARNm à proximité du codon UGASec ; une structure de type « SECIS-like » peut être prédite dans cette région. La seule présence du codon UGASec induit laccumulation de ribosomes 80S sur lARNm de SelM. Ces éléments en cis pourraient constituer des signaux essentiels pour le recrutement des ribosomes sur les ARNm de sélénoprotéines.
III.2.2 Vers lidentification de nouveaux facteurs des complexes de traduction des ARNm de sélénoprotéines
Afin didentifier de nouveaux facteurs potentiellement impliqués dans le mécanisme de traduction des sélénoprotéines, jai mis au point une méthode permettant de purifier les complexes ribonucléiques assemblés in vivo sur les ARNm de la sélénoprotéine HA-GPx1, basée sur lutilisation doligonucléotides complémentaires biotinylés. Le schéma de purification est décrit dans la Figure 69 et les mises au point expérimentales sont présentées dans la partie Matériel et Méthodes.
Figure 69. Schéma expérimental de la purification des complexes associés à lARNm de HA-GPx1 in vivo.
Un oligonucléotide ARN 2O méthylé complémentaire à létiquette HA (ARN HA-Biot) est immobilisé sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Str) et incubé en présence dextrait de cellules HA-GPx1 dans lesquels les complexes de traductions ont été préalablement bloqués à la cycloheximide. Seule la rétention dun ARNm ayant lié le ribosome est représentée sur la figure, les ARNm HA-GPx1 libres de ribosomes et associés sous forme de RNP sont également retenus. Après lavages, des oligonucléotides ADN (ADN 5HA et ADN 3HA) sont hybridés spécifiquement sur létiquette HA de lARNm HA-GPx1 en 5 et en 3 du site de loligonucléotide ARN HA-Biot. La digestion des hybrides ADN/ARN par la RNase H permet déluer spécifiquement les complexes associés à lARNm HA-GPx1, dont la composition protéique sera ensuite analysée par spectrométrie de masse.
Des extraits de cellules exprimant lARNm de HA-GPx1 de manière conditionnelle (voir Résultats 1.1), ont été purifiés par lintermédiaire dun oligonucléotide ARN 2O-méthylé et biotinylé complémentaire à létiquette HA. Les complexes protéiques assemblés sur les ARNm HA-GPx1 ont été élués par clivage à la RNase H, à laide de 2 oligonucléotides ADN shybridant de part et dautre de loligonucléotide ARN biotinylé. Le suivi de la purification par RT-qPCR est représenté dans la Figure 70A.
Figure 70. Purification de complexes associés à lARNm de HA-GPx1 in vivo.
Les complexes associés à lARNm HA-GPx1 ont été purifiés à partir dextraits de cellules HA-GPx1 induites à la doxycycline (+) ou non-induites (-) daprès la méthode présentée Figure 69. Un contrôle de purification sans oligonucléotides ARN HA-Biot (Ctrl) a été réalisé. In : extrait de départ (input), FT : surnageant (flow-through), w4= 4ème lavage (wash), E : élution. (A) Analyse du taux denrichissement relatif des ARNm HA-GPx1 par RT-qPCR, les résultats sont normalisés par rapport à HPRT et GAPDH. (B) Analyse des protéines associées à lARNm HA-GPx1 par électrophorèse sur gel SDS-PAGE et coloration au nitrate dargent.
LARNm HA-GPx1 purifié à partir dextraits de cellules induites est enrichi de 15 fois (colonne +) par rapport au contrôle de purification réalisé sans oligonucléotides biotinylés (colonne Ctrl). En absence dinduction (colonne -) une quantité non-négligeable dARNm HA-GPx1 est retenue sur les billes. Ceci est expliqué par lexistence dune expression basale de lARNm de HA-GPx1 à partir du promoteur CMV en absence dinduction. Par ailleurs, une différence significative dans la composition protéique est visible en présence doligonucléotide biotinylé comparé au contrôle sans oligonucléotide (Figure 70B, pistes 3 à 8). Cela pourrait indiquer la présence de protéines qui sont retenues par le biais de lARNm de HA-GPx1. Peu de différences sont cependant observées entre les éluats provenants des extraits induits (colonne +) et non-induits (colonne -), ce qui est vraisemblablement du à lexpression basale de lARNm de HA-GPx1 (Figure 70A). Lanalyse par spectrométrie de masse
des complexes ainsi purifiés a permis didentifier 35 protéines retrouvées spécifiquement en présence doligonucléotide biotinylé (sur un ensemble de 63 protéines retenues au total). Parmi celles-ci 7 protéines spécifiques sont également retrouvées en absence dinduction de HA-GPx1. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3.
Tableau 3. Analyse de la composition protéique de complexes purifiés associés à lARNm de HA-GPx1 in vivo, par spectrométrie de masse.
Au total, 36 protéines ont été retrouvées dans léluat contrôle (Ctrl), 13 dans léluat (-) et 63 dans léluat (+). Seules les protéines présentes dans les éluats (+) et (-) et absentes de léluat (Ctrl) sont représentées dans le tableau. Des codes couleurs ont été attribués aux protéines selon leur fonction. Spectres= Nombre de spectres fragmentés, Score= Score total Mascot. Ces valeurs sont indicatives de l'abondance des protéines dans léluat.
Les protéines identifiées sont impliquées dans différentes étapes du métabolisme de lARNm telles que la transcription, la polyadénylation, lépissage, la localisation et la traduction. Plusieurs facteurs connus comme étant impliqués dans la régulation de
lexpression des sélénoprotéines sont retrouvés : eIF4A3, la nucléoline et YBX1, ce qui semble valider notre approche expérimentale (Tableau 3). Malheureusement, les protéines SBP2 et eEFSec, essentielles au mécanisme de recodage ne sont pas retrouvées. Il a été montré que linteraction de eIF4A3 avec certains ARN SECIS, dont celui de GPx1, empêche le recrutement de SBP2 et inhibe le mécanisme de recodage des sélénoprotéines (Budiman et al., 2009a, 2011). Ceci est compatible avec nos données de purification et pourrait expliquer labsence de SBP2. La nucléoline quant à elle se lie à lélément SECIS de certains ARNm de sélénoprotéines et stimulerait leur traduction (Miniard et al., 2010; Wu et al., 2000). Enfin, la protéine YBX1 (ou NSEP1), interagit avec lélément SECIS (Fagegaltier et al., 2000d; Shen et al., 1998) et son inhibition par siARN inhibe la synthèse des sélénoprotéines, ce qui laisse suggérer quelle joue un rôle dans le mécanisme de recodage (Qichang Shen, 2006). Deux des protéines que nous avons purifié avec lARNm de HA-GPx1, hnRNP A1 et U5-116kD (U5S1 ou EFTuD2), avaient précédemment été retrouvées en interaction avec la protéine SBP2 par immunoprécipitation et crible double-hybride dans notre laboratoire (voir Figure 48A). U5-116kD est un constituant de la snRNP U5 et est impliquée dans lépissage des ARNm (Fabrizio et al., 1997). Cette protéine est un homologue du facteur délongation EF-2 (translocase du ribosome) et possède une activité GTPase. Lune de nos hypothèses étant que lARNm de SelM requière une GTPase différente de eIF2 pour lassemblage du complexe 48S (Figure 60D), la protéine U5-116kD pourrait constituer un candidat potentiel. hnRNP A1 est une des proteines les plus abondantes dans le noyau et est exprimée de manière ubiquitaire. Elle a des fonctions multiples dans la régulation de lexpression des gènes en régulant les étapes majeures de la maturation et de lassemblage des transcrit naissants (Jean-Philippe et al., 2013). La protéine contient deux domaines RRM de liaison à lARN ainsi quune région C-terminale riche en glycines et arginines qui contient un domaine de liaison à lARN tri-RGG (Jean-Philippe et al., 2013; Thandapani et al., 2013). Ce domaine est la cible de Protéines Arginyl-MéthylTransférases (PRMT) responsables de la modulation de la liaison des hnRNP à lARN (Friend et al., 2013). En plus de la nucléoline, hnRNP A1 pourrait être une cible potentielle de la protéine PRMT5, recrutée vers les ARNm de sélénoprotéine via son interaction avec la protéine SBP2 (voir Résultats II). Le rôle de U5-116kD et de hnRNPA1 dans le mécanisme de synthèse des sélénoprotéines sera étudié. Dans un
premier temps, leffet de linactivation de U5-116kD et de hnRNPA1 par siARN sur la synthèse de HA-GPx1 sera évalué. Leur interaction avec les différents facteurs de la machinerie de recodage, dont SBP2, sera analysée. La méthylation de hnRNPA1 par le méthylosome sera testée in vitro, afin de déterminer si hnRNPA1 peut être le substrat de ce complexe. Dautres protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire ont été co-purifiées avec lARNm de HA-GPx1. Si ces interactions sont impliquées dans lexpression des sélénoprotéines, cela indique que leur synthèse, en plus dêtre régulée par le taux de sélénium, pourrait dépendre du cycle cellulaire. Enfin, RBB5 ou WBP11 nont pas de fonction connue.
Au vu des différentes protéines identifiées (Tableau 3), il apparaît que notre méthode a bien permis de purifier des complexes ribonucléoprotéiques associés à lARNm de HA-GPx1 in vivo. Cependant, certaines améliorations pourront être apportées. En effet, labsence de SBP2 et des facteurs de recodage et la faible abondance de protéines ribosomiques et de facteurs de traduction, indique que peu de complexes de traduction ont été purifiés. En revanche, la présence de XRN2 et de eIF4A3, composant de lEJC (Exon Junction Complex) dans les complexes indique que ces ARNm seraient sujets au mécanisme du NMD. Il semblerait donc quau lieu de purifier des complexes de traduction, nous ayons majoritairement purifié des complexes de régulation négative de la traduction ou soumis au NMD. Il est envisageable de surexprimer SBP2 dans les cellules afin doptimiser lexpression des sélénoprotéines et de modifier potentiellement la nature et la composition des complexes purifiés. Ceci permettra sans doute dobtenir plus de complexes de traduction et donc de faciliter lidentification de facteurs impliqués dans ces mécanismes. Il a été montré que lexpression de eIF4A3 est dépendante du taux de sélénium (Budiman et al., 2009a). En effet, lorsque la concentration en sélénium est élevée (3 fois supérieure à nos conditions), lexpression de eIF4A3 est inhibée et celle de GPx1 est stimulée (Budiman et al., 2009a). Ainsi, dans les expériences futures, nous optimiserons les conditions en sélénium afin daugmenter la traduction de HA-GPx1 et de lever la répression due à eIF4A3. Il est également envisageable que nos conditions expérimentales soient trop stringentes pour maintenir certaines interactions. La concentration saline pourra être diminuée et une étape de pontage pourra être envisagée pour faciliter la détection des interactions.
Après amélioration, la même méthode sera utilisée pour purifier les complexes de traduction associés aux ARNm de HA-GPx1, HA-GPx1Cys et HA-GPx1Cys SECIS provenant des trois autres lignées cellulaires décrites précédemment (voir paragraphe II.2.2 de la partie résultats). La comparaison de la composition protéique des différents éluats permettra de différencier les protéines liées spécifiquement à la présence du codon UGASec et de lélément SECIS et intervenant peut-être dans létape de recodage des sélénoprotéines. Le rôle de ces protéines dans la synthèse des sélénoprotéines devra ensuite être validé et caractérisé. Leur impact sur le recodage par exemple pourra être évalué à laide de rapporteurs codant pour la luciférase et comprenant un codon UGASec dans la phase codante et un élément SECIS en 3UTR. Durant ma thèse, jai également construit une lignée cellulaire exprimant la protéine HA-GPx1 à partir de la séquence contenant lintron naturel du gène GPx1 (HA-GPx1+Intron). Il semblerait que la présence de lintron dans la séquence permette une meilleure expression de la protéine (Figure 71).
Figure 71. La protéine HA-GPx1 est mieux exprimée lorsque sa séquence ADN contient son intron naturel.
Après inhibition de SBP2 par siARN, la synthèse de HA-GPx1 a été induite dans les cellules HA-GPx1 et HA-GPx1+Intron pendant 24h. Des siARN dirigés contre la luciférase FFL sont utilisés comme contrôle. Lexpression de HA-GPx1 a été analysée par Western blot à laide dun anticorps anti-HA et comparée à celle de lAspRS.
Lors de lépissage, certains facteurs impliqués dans la traduction ou la stabilité des ARNm de sélénoprotéines pourraient être assemblés sur lARNm. Ces facteurs pourraient être identifiés en comparant la composition protéique des complexes associés à lARNm HA-GPx1 et HA-GPx1+Intron.
III.2.3 Vers une analyse structurale des complexes de traduction des ARNm de