Lassemblage des snRNP requière la présence de la protéine SMN sous forme dun complexe de haut poids moléculaire (Meister et al., 2001b) composé des protéines Gemin 2 à 8 et de la protéine Unrip (Charroux et al., 1999; Fischer et al., 1997; Otter et al., 2007), pour revue voir (Gubitz et al., 2004; Paushkin et al., 2002; Pellizzoni, 2007). Afin de comprendre si lensemble du complexe SMN est requis pour lassemblage des sélénoprotéines, nous avons testé linteraction des différentes protéines qui le composent avec SBP2. Nous avons montré que les protéines SMN, Gemin 2 et Gemin 3 co-immunoprécipitent avec la protéine GFP-SBP2 surexprimée dans les cellules HEK293FT, indiquant quau moins trois protéines du complexe
SMN, seraient impliquées dans lassemblage des mRNP de sélénoprotéines (Figure 47A).
Figure 47. Lensemble du complexe SMN interagit avec la protéine SBP2
(A) Immunoprécipations à partir dextraits de cellules HEK293FT transfectées par GFP-SBP2 ou GFP seul, à laide de billes anti-GFP. Les protéines co-immunoprécipitées ont été analysées par Western-blot à laide danticorps dirigés contre SMN, Gemin2 et Gemin4. (B) Tests dinteraction double-hybride réalisés dans la levure S. Cerevisae entre les protéines du complexe SMN et protéine SBP2. Des constructions exprimant les différentes protéines en fusion avec le domaine de liaison à lADN Gal4-(BD), ou le domaine activateur Gal4-(AD), ont été utilisées. La capacité des cellules à pousser sur un milieu dépourvu dhistidine et dadénine (-H Ade) indique lexistence dune interaction entre les protéines testées. Les résultats obtenus pour SBP2-BD ne sont représentés que sils diffèrent des résultats obtenus avec SBP2-AD. La protéine Nufip a été choisie comme contrôle positif et Alix comme contrôle négatif. (Résultats de M. Leichter)
Des tests dinteraction double-hybride dans la levure ont été réalisés pour tester linteraction de lensemble des protéines du complexe SMN avec SBP2 (Figure 47B, expériences réalisées par M. Leichter). La protéine Nufip a été choisi comme contrôle positif (Boulon et al., 2008). Des constructions permettant dexprimer les différentes protéines en fusion avec le domaine de liaison à lADN (BD), ou le domaine activateur (AD), du facteur de transcription Gal4 ont été utilisées. Lorsquil y a interaction entre deux protéines testées, les domaines BD et AD sont à proximité, la fonction du facteur de transcription Gal4 est rétablie et permet la croissance des cellules sur un milieu dépourvu dhistidine et dadénine. Les tests dinteraction double-hybride révèlent que les protéines Gemin 3, Gemin 4, Gemin 7 et Gemin 8 interagissent avec la protéine SBP2 (Figure 47B et Tableau 2). La protéine SMN na pas pu être testée puisquelle est capable à elle seule dactiver la transcription du promoteur Gal4 (Tableau 2 et données non incluses). Ces interactions sont vraisemblablement directes car SMN, SBP2 ainsi que tous les composants requis pour la synthèse des sélénoprotéines sont absents dans la levure S. Cerevisae. Par ailleurs nous avons montré que linteraction de SBP2 avec SMN est indépendante de lARN, puisquil est possible de co-immunoprécipier les deux protéines en présence de RNaseA (voir Chapitre I, Figure 4G de larticle (Wurth et al., 2014)), et que linteraction a également lieue lorsque les deux protéines sont traduites in vitro dans des RRL et des extraits dEscherichia coli S30 (Wurth et al., 2014, Figure 4H). Ainsi, ces résultats montrent que lensemble du complexe SMN interagit avec la protéine SBP2 et serait donc impliqué dans le recrutement de Tgs1 vers les ARNm de sélénoprotéines. Le bilan des interactions caractérisées est résumé Figure 51 et Tableau 2.
La biogenèse des snRNP fait également intervenir le complexe du méthylosome, qui assiste le complexe SMN dans lassemblage des protéines Sm sur les snARN (Chari et al., 2008; Neuenkirchen et al., 2008). Nous avons testé si le méthylosome était également impliqué dans lassemblage des ARNm de sélénoprotéines. Le cur du méthylosome composé de lenzyme PRMT5 et de la protéine MEP50, adopte une structure hétéro-octamérique (Friesen et al., 2001; Meister et al., 2001b; Stopa et al., 2015). Ce cur peut être soit associé à pICln, soit à Riok1 (Guderian et al., 2011) aboutissant à deux complexes de spécificités de substrat différentes. Ainsi, le
méthylosome associé à pICln est impliqué dans la méthylation des protéines Sm et la biogenèse des snRNP, tandis quil méthyle la nucléoline lorsquil contient RioK1 (Stopa et al., 2015). De manière intéressante, des expériences dimmunopurification des complexes endogènes associés à SBP2 dans des cellules HeLa nous ont permis de détecter lexistence dinteractions entre PRMT5, MEP50 et SBP2 (Figure 48A, daprès la thèse de Laurence Wurth, 2009).
Figure 48. Le méthylosome interagit avec SBP2 dans les cellules HeLa
(A) Immunoprécipitation de complexes endogènes associés à SBP2 (daprès la thèse de Laurence Wurth, 2009). Expériences réalisées à partir dextraits cytoplasmiques de cellules HeLa à laide danticorps anti-pepide-SBP2 ( -pepSBP2). PI : billes avec sérum pré-immun, -pepSBP2 : billes avec anticorps anti-pepide-SBP2, kDa : kiloDaltons. Les protéines présentes dans les complexes ont été détectées par spectrométrie de masse. Les protéines SBP2 et PRMT5 ont été révélées par Western blot.
(B) Immunoprécipations anti-GFP à partir dextraits de cellules HEK293FT transfectée par GFP-SBP2 ou GFP seul. Les IP ont été réalisées en présence de 100mM de NaCl (Low salt IP) ou 300 mM NaCl (High salt IP). Les protéines co-immunoprécipitées ont été analysées par Western-blot à laide danticorps dirigés contre les protéines du méthylosome PRMT5, MEP50, pICln et Riok1. (C) Co-immunoprécipitation à laide danticorps anti-GFP et dextraits cellulaires HEK293FT transfectés par GFP-PRMT5, GFP-MEP50 ou GFP-pICln et analyse des résultats par Western-blot. (AS-GB avec M. Leichter et C. Allmang)
Les deux protéines PRMT5 et MEP50 co-immunoprécipitent également avec la protéine GFP-SBP2 surexprimée dans les cellules HEK293, indiquant que les protéines cur du méthylosome interagissent avec SBP2 (Figure 48B). Ni pICln, ni Riok1 ne sont co-immunoprécipitées lorsque les lavages sont réalisés dans des conditions stringentes (300 mM NaCl). Cependant, pICln interagit avec GFP-SBP2 en conditions de faible concentration saline (150 mM NaCl), indiquant que pICln est présent au sein du complexe mais que son interaction est peu stable. Linteraction de SBP2 avec les différentes sous-unités du méthylosome a également été vérifiée par des tests dinteraction double-hybrides dans la levure (Figure 49).
Figure 49. Révélation des interactions SBP2-méthylosome par des expériences de double-hybride dans la levure.
Tests dinteraction double-hybride dans la levure S. Cerevisae entre les protéines du complexe du méthylosome et SBP2. Les résultats sont représentés comme dans la Figure 47B. (Résultats de M. Leichter)
Un signal dinteraction positif est observé pour les protéines PRMT5, MEP50 et pICln (Figure 49, Figure 51 et Tableau 2). Ainsi, il semblerait que ce soit le complexe du méthylosome comprenant la protéine pICln qui soit retrouvé en interaction avec SBP2 et non le complexe lié à Riok1. Ceci révèle une similitude de plus entre le mécanisme dassemblage des mRNP de sélénoprotéines et celui des snRNP. Afin de vérifier si ces interactions protéiques sont directes, nous avons purifié le complexe SBP2/méthylosome exprimé dans des cellules dinsectes grâce au système dexpression baculovirus (Figure 50).
Figure 50. Expression et purification du complexe méthylosome/SBP2 dans des cellules dinsectes infectées par baculovirus.
Des baculovirus recombinants permettant lexpression de GST-hSBP2 (S), hPRMT5 (P), hMEP50 (M) et HA-hpICln (I) ont été utilisés pour infecter ou co-infecter des cellules dinsecte Sf9 (Spodptera frugiperda). La purification des complexes protéiques associés à SBP2 a été réalisée par GST pull-down et analysée par Western blot à laide danticorps SBP2, PRMT5, anti-MEP50 ou anti-pICln. In : extrait cellulaire (Input).
Ce travail a été réalisé en collaboration avec léquipe de J. Cavarelli (IGBMC, Strasbourg). Des expériences de GST pull-down montrent que PRMT5 et MEP50 sont co-purifiés avec GST-SBP2 (Figure 50), confirmant que ces protéines font partie du même complexe. En revanche pICln nest pas retrouvé au sein du complexe (Figure 50), ceci est en accord avec son caractère labile (Figure 51). Ainsi, par son interaction directe avec SBP2, le méthylosome, pourrait être impliqué dans lassemblage des ARNm de sélénoprotéines et participer à leur mécanisme de synthèse.
SMN Gem2 Gem3 Gem4 Gem5 Gem6 Gem7 Gem8 Unrip PRMT5 MEP50 pICln Riok1 Y2H, AD-SBP2 / - + + - - - + - + + + nd Y2H, BD-SBP2 / - - - - - + - - - + - nd co-IP + + nd + nd nd nd nd nd + + + - co-purif nd nd nd nd nd nd nd nd nd + + - nd
Tableau 2 : Récapitulatif des interactions détectées entre les protéines des complexes SMN, du méthylosome et SBP2. Résultats obtenus par lapproche double-hybride (Y2H), par co-immunoprécipitations à partir dextraits de cellules HEK293FT (co-IP) et par co-expression et purification à partir de cellules dinsectes infectées par baculovirus. + : interaction, - : pas dinteraction, nd: interaction non-testée (indéterminable dans le cas de SMN en Y2H). Pour les expériences de double-hybride, les résultats des tests dans les deux sens de fusion de AD et BD sont représentés.
Figure 51. Représentation schématique du réseau dinteraction protéine-protéine entre SBP2 et les complexes SMN et méthylosome.
Etabli expérimentalement par lapproche double-hybride (flèches noires), par co-immunoprécipitations à partir dextraits de cellules HEK293FT transfectées (flèches bleues) et par co-purification de SBP2 à partir de cellules dinsectes infectées par baculovirus (flèches rouges) ou par co-immunoprécipitation de protéines endogènes dans les cellules HeLa (flèches jaunes). Les chiffres dans le complexe SMN correspondent aux protéines Gemin 2-8. Pour simplifier, nous avons représenté les complexes SMN et méthylosome de manière non-stoechimérique (Pellizzoni, 2007; Stopa et al., 2015). MEP50 et PRMT5 sont les protéines Coeur du méthylosome; pICln et RioK1 sont deux protéines associées à des complexes du méthylosome distincts (Guderian et al., 2011; Stopa et al., 2015; Yong et al., 2004).
II.2.2 Linhibition des complexes SMN et du méthylosome a un impact