IV.2.1. Introduction
Afin de déterminer un effet radioprotecteur vis-à-vis des radiations γ, nous soumettons une solution d’ADN plasmidique pBR322 dans 30 µ L de tampon phosphate 5 mM (pH 7,4, NaCl 10 mM) à différentes doses d’irradiation γ (60 Gy/h) par une source cobalt 60 à température ambiante en présence et en absence des différents composés testés. Les irradiations ont été réalisées en présence et en absence des différents composés à différentes concentrations.
De la même façon que pour la réaction de Fenton, nous séparons les différentes formes d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose et nous quantifions chacune d’elle.
Nous calculons ainsi les pourcentages d’ADN sous forme circulaire relaxée et les pourcentages de protection pour chacun des dérivés testés.
IV.2.2. Conditions expérimentales
Différentes solutions contenant de l’ADN plasmidique pBR322 (1,25 µg soit 42 µg/mL) dans 30 µL de tampon phosphate 5 mM (pH 7,4, NaCl 10 mM) ont été exposées à une irradiation par une source Cobalt 60 à différentes doses (débit de dose à 50 Gy/h) à 25°C en présence et en absence des différents composés. Les doses d’irradiation sont similaires à celles utilisées dans la littérature pour des tests similaires [124].
Après irradiation, 10 µ L de bleu de bromophénol (75% glycérol, 24,95 % tampon Tris, 0,05 % bleu de bromophénol) sont ajoutés à chaque échantillon. Les coupures de l’ADN consécutives à l’irradiation ont été révélées par électrophorèse sur gel d’agarose 0,8 % contenant 25 µl de bromure d’éthidium (10 mg/ml). La migration est réalisée pendant 16 heures à 20 V dans du tampon tris borate EDTA (10,8 g/L de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 5,5 g/L acide borique, 0,93 g/L d’EDTA). Le gel est ensuite analysé et les différentes formes d’ADN plasmidique ont été révélées par illumination sur une table UV à 254 nm. Après photographie, une quantification des bandes a été réalisée par densitométrie à l’aide d’un logiciel Mesurim. Nous avons pu ainsi déterminer les pourcentages d’ADN sous forme relaxée qui correspond à la forme endommagée et les pourcentages de protection comme dans le test précédent.
IV.2.3. Résultats
IV.2.3.1. Thiols (11-15)
Afin de confirmer les résultats obtenus précédemment et d’évaluer un pouvoir radioprotecteur « réel », nous soumettons de l’ADN plasmidique à des radiations gamma par une source Cobalt 60 (10 et 15 Gy) en présence et en absence des dérivés suivants : 11, 12, 14, 15, WR-2721 et WR-1065. Les coupures de l’ADN consécutives à l’irradiation ont été révélées par électrophorèse sur gel d’agarose. La figure 40 montre un exemple de gel d’électrophorèse obtenu après une irradiation de 10 Gy en présence du composé 15.
Figure 40 : Electrophorèse sur gel d’agarose obtenu après exposition de l’ADN à des
radiations gamma (10 Gy) en présence et en absence du composé 15 (50 µM; 100 µM; 200 µM). Colonne 1 : ADN exposé aux radiations gamma. ADN exposé aux radiations gamma en présence du composé 15 ; colonne 2 : 50 µM, colonne 3 : 100 µM, colonne 4 : 200 µM. colonne 5 : ADN non traité.
Les résultats quantitatifs sont représentés figure 41. Une étude statistique est réalisée visant à comparer par un test de Student les moyennes des pourcentages d’ADN sous forme circulaire relaxée dans les échantillons traités en présence de produits avec la moyenne du pourcentage d’ADN sous forme circulaire relaxée dans le témoin non traité (** : différence très significative, * : différence significative).
Forme superenroulée = forme intacte ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ - 0 50 100 200 0 1 2 3 4 5 Irradiation Composé 15
Forme circulaire relaxée =
forme endommagée, coupure simple brin (FII) (FI)
Irradiation 10 Gy Irradiation 15 Gy
Figure 41 : Représentation des pourcentages d’ADN sous forme circulaire relaxée après
irradiation gamma (10 Gy et 15 Gy) en présence ou en absence des composés 11, 12, 14, 15. Tous les échantillons ont été réalisés en triplicates et les valeurs figurées sont des valeurs moyennes
±
écart type. * produit + irradiation gamma versus témoin non irradié, p < 0,05, ** produit + irradiation gamma versus témoin non irradié, p < 0,01.Ces histogrammes montrent que quelque soit la dose d’irradiation nous avons une augmentation significative des dommages radio-induits de l’ADN. A 10 Gy, nous obtenons 36,99 ± 0,90 % d’ADN sous forme circulaire relaxée contre 25,46 ± 0,91 % dans l’échantillon non irradié. Les taux de coupures simple brin sont légèrement supérieurs après une irradiation gamma qu’après une réaction de Fenton.
ADN irradié ADN non irradié 0 10 20 30 40 50 100 200 ** ** * Concentration (µM) Pourcentage forme circulaire relaxée ADN irradié ADN non irradié 50 100 200 0 10 20 30 40 * ** Concentration (µM) circulaire relaxée Pourcentage forme circulaire relaxée benzothiazole-2-thiol (11) 6-méthylbenzothiazole-2-thiol (12) 5-éthylthio-1,3,4-thiadiazole-2-thiol (14) 5-éthyl-1,3,4-thiadiazole-2-thiol (15)
ADN non irradié ADN irradié
Pour une dose d’irradiation de 10 Gy, les résultats obtenus témoignent toujours d’une grande efficacité des thiols. Dès la plus faible concentration (50 µM) nous pouvons considérer que nous avons une protection totale de l’ADN en particulier avec le composé 12. En effet, nous observons autant d’ADN sous forme circulaire relaxée (28,78 ± 0,85 %) que dans l’échantillon non irradié.
Les pourcentages de protection calculés à 100 µM, pour une dose d’irradiation de 10 Gy, des composés 11, 12, 14 et 15 sont respectivement de 64,70 ± 7,43 %, 100,00 ± 7,66 %, 71,12 ± 5,61 % et de 63,59 ± 3,27 %. Nous avons également calculé les pourcentages de protection du WR-1065 et du WR-2721 à 100 µM et à la même dose d’irradiation ; ils sont respectivement de 22,25 % ± 3,02 et de 0,32 % ± 2,49 à 10 Gy.
Ces résultats attestent donc que les thiols apportent une meilleure protection de l’ADN que le composé de référence dans le domaine et son métabolite, à savoir le WR-2721 et le WR-1065.
Concernant la dose de 15 Gy, il faut noter que l’augmentation des dommages de l’ADN dans le témoin irradié est minime par rapport à la dose de 10 Gy. En effet, les pourcentages d’ADN sous forme relaxée pour les deux doses d’irradiation sont très proches : 36,99 ± 0,90 % à 10 Gy contre 41,91 ± 0,59 % à 15 Gy.
A cette dose, nous obtenons une protection totale de l’ADN avec les composés 12 et 14 dès 50 µM.
En comparaison avec le WR-1065 et le WR-2721, les pourcentages de protection calculés à 100 µM pour l’ensemble des composés restent supérieurs à ceux du WR-2721 et du WR-1065. En effet, pour le composé 11, à 100 µM, nous obtenons 73,09 ± 3,68 % de protection. Pour les trois autres composés, nous avons une protection estimée à 100 % alors que pour le WR-2721 et le WR-1065, les protections sont estimées à 15,89 ± 5,76 % et 40,84 ± 6,34 %.