Isolement des composants non membranaires

L’isolement des constituants non membranaires a été réalisé par filtration de la phase aqueuse récupérée lors de la libération des corps lipidiques (pour éviter toute présence d’oléosomes), suivie d’une lyophilisation de façon à éliminer l’eau présente.

P.3 Protocole

La phase aqueuse issue du procédé intégrée a d’abord été centrifugée 5 minutes à 10 000
g et à 6 °C, pour ensuite être filtrée à l’aide d’une membrane en nitrate de cellulose d’une porosité de 0,45 µm. Après filtration, le milieu est séché à l’aide d’un lyophilisateur Cryo-Rivoire afin d’obtenir ces composants en poudre.

2.2.5 Purification de la trioléine

La trioléine est prise comme huile modèle pour les études des cinétiques d’adsorption et les études de caractérisation rhéologique des phospholipides et des oléosines. Le but est d’éviter les possibles interférences dues aux constituants mineurs de l’huile de colza. La trioléine est un triglycéride constitué de trois chaînes oléiques. Ces acides gras sont majoritaires dans la graine de colza. La trioléine a été purifiée selon le protocole décrit par Gaonkar12_.

P.4 Protocole

La trioléine, provenant de chez Sigma-Aldrich (L'Isle d'Abeau Chesnes, France), est purifiée par filtration sur colonne de silice florisil préalablement activée à 160 °C pendant 16 heures. 20 grammes de silice florisil ont été employés par litre de trioléine. Pour éviter tout phénomène d’oxydation, le montage a été protégé de la lumière et de l’oxygène et mis sous courant d’azote.

2.3

Activité interfaciale des constituants purifiés

Tout d’abord nous avons étudié l’activité interfaciale de chaque constituant pris séparément. L’activité interfaciale est évaluée par mesure des tensions à l’interface huile/eau, où l’huile est de l’huile de colza commerciale et l’eau est déminéralisée. Ces mesures ont été réalisées avec un tensiomètre équipé d’une lame de Wilhelmy en platine à une température de 25 °C.

Figure 4 : Schéma de la lame de Wilhelmy plongée entre deux liquides non miscibles avec les paramètres qui

interviennent dans la mesure de tension interfaciale

Cet outil sert à mesurer la tension interfaciale à partir de mesures de la force nécessaire pour décrocher cette lame de l’interface étudiée. Le bilan des forces verticales montre qu’à l’équilibre, soit au moment de l’arrachage de la lame de l’interface, la force F supportée par la lame est égale à la force fournie par l’interface (Figure 4). On peut donc écrire l’équation : θ ⋅ = γ cos P F où :

F est la composante verticale de la tension de surface (γ) θ est l’angle de contact du ménisque avec la lame

P.5 Mesure de tension interfaciale : Lame de Wilhelmy

Ces mesures ont été réalisées avec un tensiomètre GBX, 3S (Drôme, Romans-sur- Isère, France) équipé d’une lame de Wilhelmy en platine à une température de 25 °C. L’huile de colza est commerciale (Lesieur, Asnières-sur-Seine, France), tandis que l’eau est purifiée avec le système de filtration Milli-Q Millipore (Milford, USA). Les constituants à étudier sont dissous dans la phase où ils sont le plus solubles : les protéines (oléosines et composants non membranaires) dans l’eau et les phospholipides dans l’huile à une concentration de 5 et 1 % respectivement. Les deux phases sont introduites dans un cristallisoir en respectant l’ordre affiché dans le Tableau 3.

Tableau 3 : Mesures de tension interfaciale (TI) dans le système huile/eau en présence des différents

constituants Système

Phase Supérieure Phase Inférieure

TI [mN/m]

Huile Eau 12,8

Huile + Phospholipides Eau 0,0

Huile Eau + Composants Non membranaires 13,9

Huile Eau + Oléosines 3,7

D’après les résultats répertoriés dans le Tableau 3, les phospholipides et les oléosines ont montré une activité à l’interface huile/eau en diminuant considérablement la tension interfaciale (TI). D’autre part, les composants non membranaires ont un effet négatif et peu significatif sur l’activité interfaciale. Nous concluons ainsi que ce sont les constituants membranaires qui présentent les meilleures propriétés tensioactives.

2.4

Reconstitution d’oléosomes

Après cette étude physicochimique préliminaire, nous avons essayé de réaliser la reconstitution d’oléosomes pour observer l’effet microscopique et macroscopique des phospholipides et des oléosines vis-à-vis de la stabilisation des corps lipidiques. Des essais ont été réalisés en utilisant différentes proportions phospholipides/oléosines (PL/OL) afin d’évaluer l’influence des oléosines et des phospholipides individuellement sur la stabilisation de ces systèmes émulsionnés, et de mettre en évidence une possible synergie d’actions de ces

constituants.

Les reconstitutions ont été effectuées avec les phospholipides et les oléosines qui ont été préalablement isolés. De l’huile de colza raffinée achetée dans le commerce, Lesieur (Asnières-sur-Seine, France), et de l’eau purifiée avec le système de filtration Milli-Q, ont constitué les phases principales de ces reconstitutions. Ces reconstitutions ont été réalisées sans modification du pH (pH natif = 5,5). Dans le Tableau 4, les compositions massiques des différents essais sont indiquées. Nous avons maintenu les compositions d’eau et d’huile constantes dans toutes les reconstitutions. Nous observons aussi que l’essai 7 est le seul à avoir dans sa composition de composants non membranaires. Celui-ci a été réalisé pour évaluer justement le rôle que ces constituants exercent dans la stabilité de corps lipidiques. Cet essai a été réalisé avec la proportion PL/OL=0,015 théorique dans les oléosomes natifs.

Tableau 4 : Compositions en pourcentages massiques (%) des différents constituants dans les différents essais

de reconstitutions d’oléosomes

Essai 1 Essai 2 Essai 3 Essai 4 Essai 5 Essai 6 Essai 7 Constituants

PL=0 OL=0 PL/OL=50 PL/OL=5 PL/OL=0,5 PL/OL=0,015 PL/OL=0,015

Oléosines 2,00 0,00 0,04 0,33 1,33 2,00 2,00 Phospholipides 0,00 2,00 1,96 1,67 0,67 0,03 0,03 Composants Non Membranaires 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,00 Huile 38,00 38,00 38,00 38,00 38,00 38,00 34,00 Eau 60,00 60,00 60,00 60,00 60,00 60.00 60.00 P.6 Protocole

Les différentes préparations sont réalisées dans des tubes à essais de 10 mL. Les constituants sont ajoutés en introduisant d’abord les phospholipides et les oléosines pour permettre une compétitivité d’absorption aux molécules, due à la capacité d’absorption élevée qui peut entraîner des différences à cause de l’ordre d’ajout. L’émulsification a été effectuée à l’aide d’une sonde d’ultrasons (SONICS Vibracell) pendant 3 minutes à 20 kHZ et 200 W, avec une alternation de sonication et relaxation de 5 s/25 s pour éviter l’échauffement excessif de la préparation. Tous les essais ont été stockés à température ambiante.

Les rôles et interactions des constituants dans la stabilité de corps lipidiques ont été évalués par la taille moyenne de gouttelettes, les valeurs absolues de potentiel zêta ainsi que par l’observation des phénomènes de déstabilisation : la floculation et le crémage.