Immunoprécipitation de la chromatine

Protocole par le Dr. Nelson211.

2.8.1. Fixation et récolte cellulaire

Toutes les étapes sont effectuées sur glace pour protéger les protéines de la dégradation. Un nombre de 10 millions de cellules par immunoprécipitation de la chromatine sont incubées dans des pétris 150 mmF1. Les cellules sont fixées avec de la formaldéhydeF2 [37%] à une concentration finale de 1.42% pendant 10 minutes. Le formaldéhyde est inhibé avec de la glycineF3 [1M] à une concentration finale de [141 mM] pendant 5 minutes. Les cellules sont lavées deux fois au PBS [1x] froid et elles sont grattées et transférées dans un tube de 1.5 mlF4. Les cellules sont centrifugées à 2000g pendant 5 minutes et le surnageant est aspiré.

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2.8.2. Lyse cellulaire

Le culot cellulaire est lysé avec du tampon d’immunoprécipitation froid (NaClF5 [150mM], TrisF6-HCLF7 [50mM] pH 7.8, EDTAF8 [5mM], NP-40F9 [0.5% vol/vol] et Triton X-100F10 [1% vol/vol]) contenant des inhibiteurs de protéases (PMSFF11 [0.1M] et leupeptineF12 [10 µg/ml]). L’échantillon est centrifugé à 12 000g pendant 5 minutes et le surnageant est aspiré. Le culot nucléaire est lysé à nouveau avec du tampon d’immunoprécipitation froid contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est centrifugé à nouveau et le surnageant est aspiré. Le culot nucléaire est lysé une dernière fois avec du tampon d’immunoprécipitation froid contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est séparé en deux parties pour augmenter l’efficacité de la sonication.

2.8.3. Sonication

Chaque échantillon est soniqué par ultrason avec un sonicateurF13 possédant une sondeF14 1/8 pour permettre le déchirement de l’ADN en longueur de 1 à 5 nucléosomes. Les conditions de sonication sont les suivantes : 10 répétitions de 15 secondes à la puissance 10 sur 20 sur glace. Par la suite, les échantillons sont centrifugés 12 000g pendant 10 minutes et le surnageant de tous les échantillons est transféré dans un même tube de 15 mlF15. Le tout est mélangé par inversion douce.

2.8.4. Immunoprécipitation

Ensuite, le mélange est séparé en un aliquote servant de référence, congelé à -80°C, un aliquote pour vérifier la sonication de l’échantillon, congelé à -80°C, un volume pour servir de bruit de fond et un volume par anticorps. Les aliquotes sont de 1x105 cellules et les volumes d’immunoprécipitation sont de 1x107 cellules. Les anticorps pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt sont ajoutés. La quantité d’anticorps varie entre 2 µg et 8 µg (Liste en annexe). Un anticorps normal de lapin de type IgG est utilisé pour l’échantillon de bruit de fond. Il permet en effet de réduire l’ADN non spécifique en diminuant son interaction avec les billes. Les échantillons avec les anticorps sont incubés à 4°C toute la nuit sur un rotatoire. Le lendemain, les échantillons sont centrifugés à 12 000g pendant 10 minutes. Pendant ce temps, les billes d’agarose AF16 ou GF17, selon les types

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d’anticorps, sont lavées 3 fois avec du tampon d’immunoprécipitation pour enlever l’éthanol des billes. Un lavage consiste à ajouter du tampon, centrifuger à 2000g pendant 1 minute et aspirer le surnageant avec précaution. Ensuite, les billes sont pré-nettoyées avec de la BSA [5%] pendant 30 minutes sur rotatoire. Une fois la centrifugation des échantillons de 10 minutes terminée, 90% du surnageant est transféré dans les billes d’agarose. Les échantillons sont incubés pendant 45 minutes à 4°C sur le rotatoire. Après l’immunoprécipitation, les billes d’agarose sont lavées 5 à 6 fois. Un lavage consiste à centrifuger les billes à 2000g pendant 1 minute à 4°C et aspirer le surnageant. Le tampon d’immunoprécipitation froid est ajouté pour laver les billes. Une fois les lavages terminés, il faut aspirer complètement le tampon des billes d’agarose.

2.8.5. Préparation de l’ADN

Pendant l’immunoprécipitation, la référence et l’échantillon sont décongelés pour vérifier la qualité de la sonication. L’ADN est précipité avec de l'éthanol [100%] et incubé à température pièce 10 minutes. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 3 minutes à 4°C et le surnageant est aspiré. Ensuite, le culot d’ADN est lavé avec de l’éthanol [75%], centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le surnageant est aspiré. L’ADN est séché pendant 15 minutes à température pièce. Une fois terminée, du chelex-100F18 [10%] est ajouté aux échantillons.

2.8.6. Isolation de l’ADN

Du chelex-100F18 [10%] est ajouté aux billes d’agarose des échantillons et de la protéinase KF19 [20 µg/ µl]. Les échantillons sont incubés à 55°C pendant 30 minutes. Ensuite, ils sont bouillis pendant 10 minutes. Ces deux étapes permettent de dégrader les protéines pour ne conserver que l’ADN. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le surnageant est transféré dans un nouveau tube de 1.5 mlF4. De l’eau Milli-Q est ajoutée pour laver les billes et le chelex-100F18. Les échantillons sont centrifugés à nouveau et le surnageant est transféré avec l’autre surnageant.

2.8.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative

L’expression des gènes d’intérêt est quantifiée en temps réel avec une PCR quantitative. L'ADN immunoprécipité est mélangé avec de l'H2O Milli-Q, des amorces de gauche et de

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droite [5 µM] et du Sybr GreenE1 [2x] dans une plaque 96 puitsE2. La plaque est scellée avec un film collantE3. Le protocole est le suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant 10 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 15 secondes, liaison des amorces à l’ADNc et élongation de l'ADN à 60°C pendant 1 minute. Les deux dernières étapes sont répétées 40 cycles. La qualité des amorces est vérifié une courbe de dissociation allant de 65°C à 95°C par 0.5°C pendant 0.05 seconde. Les résultats sont comparés à l’enrichissement au dessus du bruit de fond. En d’autres mots, lorsque la protéine est présente au promoteur du gène d’intérêt, l’immunoprécipitation a enrichi la quantité d’ADN disponible, contrairement au contrôle négatif. Par conséquent, plus l’enrichissement est élevé par rapport au contrôle négatif, plus la protéine est présente au promoteur du gène. Liste des amorces en annexe.

2.8.8. Vérification de la sonication

Les résultats de la sonication sont vérifiés sur un gel d'agarose [1%]. Le gel est obtenu en mélangeant 1% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6 [40mM], acide acétique glacialF20 [20mM] et EDTAF8 [1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé aux micro-ondes pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10 mg/ml] est ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons ultraviolets. Les échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure. Les résultats sont observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 100 paires de basesF21 [500µg/ml].