Clonage moléculaire

2.9.1. Réaction en chaîne par polymérase

Les échantillons sont amplifiés à partir d'une librairie d'ADN complémentaire obtenue suite à l'extraction d'ARN et d'une réaction de transcription inverse. Les amplifications ont été effectuées avec deux types d'enzymes selon les besoins, soit la Pfu ADN polymérase et la

Taq polymérase.

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Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de Phire IIG2 [5x], des dNTPsG3 [10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de l'ADNc, du DMSOG4 [100%], du CES [5x] (un amplificateur permettant une meilleure amplification des régions riches en GC), de la Phire IIG1 et le tout est complété avec de l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de l'enzyme à 98°C pendant 30 secondes, dénaturation de l'ADN à 98°C pendant 10 secondes, appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à 40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C pendant 10 minutes. Étant donné les bouts francs laissés par la Pfu ADN polymérase, de la

Taq polyméraseG5 est ajouté aux échantillons avec une incubation additionnelle à 95°C pendant 5 minutes pour activer la Taq polymérase et 72°C pendant 15 minutes pour ajouter une queue de poly-A. Liste des amorces en annexe.

Taq polyméraseG5 :

Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de Taq polyméraseG6 [10x], des dNTPsG3 [10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de l'ADNc, du MgCl2G7 [25mM], du CES [5x], de la Taq polyméraseG5 et le tout est complété avec de l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant 5 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 30 secondes, appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à 40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C pendant 10 minutes. Liste des amorces en annexe.

2.9.2. Gel d’agarose

Tous les produits obtenus par PCR sont vérifiés sur gel d'agarose [0.8%]. Le gel est obtenu en mélangeant 0,8% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6 [40mM], acide acétique glacialF20 [20mM] et EDTAF8 [1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé au four à micro- ondes pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10 mg/ml] est ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons ultraviolets. Les échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure.

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Les résultats sont observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 1000 paires de basesG9 [500µg/ml].

2.9.3. Purification d’ADN

Les bandes sélectionnées sur le gel d'agarose sont coupées avec l'aide d'un scalpel et déposées dans un tube 1.5 mlF4. Trois volumes de tampon QX1G9 sont ajoutés par 100 mg de bandes d'agarose extraites pour permettre la dégradation de l'agarose. La solution QX2G10 est ajoutée au mélange pour lier l'ADN resuspendu. Le tout est incubé à 50°C pendant 10 minutes pour entamer la dégradation de l'agarose. Ensuite, l'échantillon est centrifugé à 13000 rpm pendant 30 secondes. Le culot est lavé avec la solution QX1G9 pour enlever les traces d'agarose restantes. Le tout est centrifugé à nouveau à 13000 rpm pendant 30 secondes. Le culot est ensuite nettoyé deux fois avec la solution tampon PEG11 pour éliminer les sels. Le culot est séché pendant 10 à 15 minutes à l'air pour finalement être élué dans de l'H2O Milli-Q.

2.9.4. Digestion enzymatique

Les échantillons d'ADN purifié sont mélangés avec les enzymes de restriction (Liste en annexe) et leur tampon respectifG12-G13-G14-G15. De plus, pour certaines enzymes, de la BSAG16 est ajoutée. Toutes les digestions sont incubées à 37°C pendant 1 heure et vérifiées sur un gel d'agarose [0.8%].

2.9.5. Déphosphorylation de vecteurs

Une fois digérée, les vecteurs sont déphosphorylés pour empêcher qu'ils ne se referment sur eux-mêmes en mélangeant : le tampon de phosphatase alcalineG17 [2x], le vecteur et la phosphatase alcalineG18 [10000U/ml]. Le mélange est incubé à 37°C pendant 30 minutes. La phosphatase est ensuite inactivée en incubant à 65°C pendant 10 minutes.

2.9.6. Ligation

Les ligations sont effectuées en mélangeant l'ADN à insérer avec un vecteur, le tampon de ligation [2x], la ligase T4G19 [400000U/ml] et en complétant avec de l' H2O Milli-Q. Les échantillons sont par la suite incubés à 16°C toute la nuit.

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2.9.7. Transformation bactérienne

Une partie du produit de ligation est mélangée avec des bactéries TOP10F' chimio- compétentes et incubée sur glace pendant 30 minutes. Par la suite, un choc thermique est effectué en déposant l'échantillon dans un bain à 42°C pendant 45 secondes, suivi d'un retour sur glace pour permettre l'entrée du plasmide dans les bactéries. Du milieu de culture LB est ajouté pour la croissance des bactéries et elles sont déposées à 37°C avec agitation de 200 rpm pour 1 heure. Le mélange est finalement déposé sur pétri LB contenant l’antibiotique approprié selon la résistance du plasmide.

2.9.8. Extraction plasmidique de petites quantités (Miniprep)

Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20 contenant l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21 [50%]. Le reste des bactéries sont centrifugées à 13 000 rpm pendant 30 secondes et resuspendues avec la solution IG22. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution IIG23 pendant 1 minute à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution IIIG24 en incubant 1 minute à température pièce. Les débris cellulaires sont éliminés en centrifugeant 12 000 rpm pendant 5 minutes et le surnageant est transféré sur colonneG25. La colonne est centrifugée à 10 000 rpm pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La colonneG25 est lavée deux fois avec la solution de lavage pour éliminer les restes d'ADN bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever les traces de la solution de lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon d'élution.

2.9.9. Séquençage

Toutes les constructions plasmiques sont séquencées par la plate-forme de séquençage pour vérifier que les plasmides sont exacts.

2.9.10. Extraction plasmidique de moyennes quantités (Midiprep)

Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20 contenant l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21 [50%].

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Le reste des bactéries sont centrifugées à 5 000g pendant 10 minutes et resuspendues avec la solution de resuspensionG26. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution de lyseG27 pendant 4 minutes à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution de neutralisationG28. Une solution d'attachementG29 est ajoutée pour permettre une meilleure adhésion des plasmides à la colonne. Les débris cellulaires sont éliminés en passant sur seringueG30 l'homogénat et le tout est transféré sur colonneG31. La colonne est centrifugée à 3 000g pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La colonne est lavée deux fois avec la solution de lavage IG32 et la solution de lavage IIG33 pour éliminer les restes d'ADN bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever les traces de la solution de lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon d'élutionG34.