Nous avons ensuite greffé CouCHO sur ces 3 plaques, afin de déterminer si le capping a ou non, réussi : si nous ne détectons aucun signal de CouCHO sur les supports, nous pourrons alors en déduire que l’acide dodécanoïque a bien été greffé sur toute la surface.
Le greffage de CouCHO sur les supports a été réalisé comme décrit dans la deuxième partie (partie B, § B.V.3.1.). Pour chacune des plaques, la fluorescence a été mesurée en huit points. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 92, sur laquelle nous avons également reporté le signal d’une lame S vierge greffée avec ce même traceur.
Figure 92 Protection chimique des –NH2 par l’acide dodécanoïque : plaques testées avec CouCHO Spectres d’émission de fluorescence (λexc = 423 nm, mode Sc/Rc, f = 3 nm)
Nous avons reporté sur la figure 92 les spectres de fluorescence moyens obtenus pour chacune des trois plaques, ainsi que la dispersion autour de la valeur moyenne, mesurée au maximum de fluorescence, à 470 nm.
Après 3 h de capping, les spectres réalisés sont similaires à ceux d’une lame S vierge greffée avec CouCHO : à ce stade de la réaction, le greffage de l’acide dodécanoïque sur le support est peu visible. Le greffage est par ailleurs très inhomogène sur toute la longueur de la plaque (42 % d’écart maximum !).
Après 6 h et 24 h, on détecte encore la fluorescence de CouCHO, mais bien moins qu’après 3 h : cette fluorescence résiduelle représente 21 % après 6 h, et 19 % après 24 h. Le greffage de CouCHO sur les supports est donc réduit d’environ 80 % lorsque le capping est réalisé avec succès, soit au bout de 6 h ; en effet, les résultats obtenus ne sont pas significativement meilleurs après 24 h. On remarque par ailleurs que dans ce cas, le signal reste faiblement dispersé : ceci indique que le greffage de l’acide dodécanoïque est homogène sur toute la surface des supports.
Nous avons renouvelé l’expérience avec d’autres lames S vierges qui ont été immergées dans le même milieu que précédemment pendant 6 h. Les résultats n'ont pas été reproductibles : le greffage du bras n'a été observé que dans un cas sur deux.
Nous avons également testé une méthode classique de protection chimique des fonctions amines décrite dans la littérature [G. Grandjean et al., 2002], faisant intervenir l’anhydride acétique : les résultats obtenus n’ont pas été plus reproductibles que dans le cas précédent.
A ce stade de l’étude, nous n’avons pas d’explications permettant de justifier ces échecs, d’autant que nous sommes parvenus à acyler les supports avec d’autres composés similaires, tels que l’anhydride succinique (cf. partie E, § E.II.1.) ou les esters de succinimidyle des traceurs fluorescents.
D.IV. Conclusion
Nous avons dans un premier temps étudié la localisation des greffages à l’intérieur de puits en polymère fabriqués suivant le protocole décrit dans la troisième partie (partie C). Les deux traceurs fluorescents acides étudiés dans la partie B ont été utilisés. Les greffages localisés ont été réalisés par des dépôts à l’intérieur des puits ou par mouillage de la surface polymérisée par les solutions. Les analyses par fluorescence ont été effectuées au spectrofluorimètre et au microscope à fluorescence. Ces deux techniques sont complémentaires et renseignent bien sur la qualité et la localisation des greffages.
Nous retiendrons de cette étude que le greffage reste parfaitement localisé à l’intérieur des puits à condition de procéder par dépôt ; en effet, il semble que le polymère soit perméable aux solutions, car lorsqu’on opère par mouillage, on détecte du greffage, en faible proportion toutefois, au niveau des sites réactionnels protégés. Le greffage par dépôt a cependant pour inconvénient qu’il est réalisé sans agitation, ce qui conduit à un recouvrement inhomogène.
Les deux traceurs fluorescents acides (CiNHS et CouNHS) ont pu être greffés isolément sur une même lame, à l’intérieur d’une matrice de puits en polymère (dth = 5 mm). Il nous a par ailleurs été possible d’étudier le greffage au cours du temps des deux fluorophores, dans différents puits sur un même support, et ainsi de déterminer la durée optimale de greffage pour chacun d’entre eux : le recouvrement maximum de la surface est atteint au bout de 24 h.
Concernant la méthode de localisation basée sur la fabrication de plots en polymère, nous avons pu vérifier qu’il était possible de réaliser des greffages covalents au niveau des sites protégés par le polymère, mais nous ne sommes jusqu’ici pas parvenus à mettre au point une méthode de protection chimique des sites réactionnels –NH2 qui soit reproductible.
Après avoir montré qu’il était possible de réaliser des greffages covalents et localisés sur les supports, nous allons à présent procéder à leur fonctionnalisation devant permettre le
greffage orienté d’anticorps, et plus généralement de composés porteurs d’une fonction aldéhyde.
5ème partie : Partie E
E
E.. PPRRÉÉPPAARRAATTIIOONN DDEESS SSUUPPPPOORRTTSS
E
ENN VVUUEE DDUU GGRREEFFFFAAGGEE
O
ORRIIEENNTTÉÉ DD''AANNTTIICCOORRPPSS
Introduction
Le but de cette étude consiste à proposer un modèle de support sur lequel différents anticorps pourront être greffés de façon parfaitement localisée, avec pour objectif le développement d’un biocapteur.
Nous avons dans un premier temps utilisé des molécules plus simples pour valider les techniques de localisation des greffages : comme nous venons de le décrire dans la partie précédente, des traceurs fluorescents ont été greffés par une liaison amide à l’intérieur de puits réactionnels, créés dans une matrice polymère par stéréolithographie.
Nous allons à présent fonctionnaliser les supports en vue de réaliser le greffage covalent d’anticorps. Nous avons retenu de l’étude bibliographique deux points importants concernant le greffage d’anticorps. Le premier consiste à les immobiliser par leur fragment Fc afin d’optimiser l’interaction spécifique anticorps/antigène en rendant les sites de liaisons avec l’antigène accessibles. Le second point concerne l’utilisation d’un bras espaceur, réduisant les effets d’encombrement stérique et empêchant l’adsorption des anticorps sur la surface des supports. Pour pouvoir répondre à ces exigences, nous avons choisi de fonctionnaliser les supports avec un bras espaceur de type polyoxyéthylène, terminé par une fonction aminooxy ou hydrazide permettant le greffage dans des conditions douces d’anticorps ou d’autres composés porteurs d’une fonction aldéhyde.
Après avoir présenté les stratégies envisagées pour préparer des supports fonctionnalisés, nous décrirons les différentes étapes entrant dans la synthèse du bras espaceur et nous présenterons les essais qui ont permis de confirmer l’introduction des différentes fonctions en cours de synthèse.
E.I. Préparation des supports fonctionnalisés
Pour greffer les anticorps sur les supports de telle sorte qu’ils soient correctement orientés, l’approche consistant à les immobiliser par leur fragment Fc via une liaison covalente a été retenue [Vijayendran & Leckband, 2001 ; Gering et al., 2002]. Les carbohydrates présents sur ce fragment sont oxydés pour créer des fonctions aldéhyde, lesquelles vont pouvoir former des liaisons stables avec des fonctions de type amine.
Pour réaliser la synthèse du bras espaceur présentant les fonctions terminales appropriées, nous nous sommes appuyés sur les travaux réalisés par Lee et Shin (2005a) concernant le greffage covalent de saccharides sur des lames de verre silanisées : les fonctions aminooxy (-ONH2) et hydrazide (–CONHNH2) ont ainsi été retenues pour fixer les carbohydrates (après oxydation) sur les supports, via une chaîne de type polyoxyéthylène. Ces deux modes de fixations des anticorps sur des supports silanisés –NH2 sont représentés sur la figure 93 :
Figure 93 Bras espaceur terminé par une fonction aminooxy (A) ou hydrazide (B)