Le composé CouNHS (0,036 g, 0,10 mmol) est préalablement dissous dans 1 mL de DMF complété avec 19 mL d’une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à pH 8,5. Les lames S sont immergées 4 h dans cette solution, sous légère agitation magnétique, à température ambiante et à l’abri de la lumière. Elles sont ensuite soigneusement rincées par immersion dans différents solvants (3 h dans H2O, 3 h dans EtOH, 2 h dans CH2Cl2) sous agitation magnétique, puis séchées.
B.VI. Conclusion sur les greffages sur supports
Nous avons dans cette partie étudié le greffage covalent de traceurs fluorescents sur des lames de verre fonctionnalisées avec un amino-silane. Pour des raisons pratiques, nous avons choisi d’utiliser des supports commerciaux, à savoir des lames de verre silanisées -NH2 en surface (lames S), que nous avons caractérisé du point de vue de leurs propriétés physico-chimiques : nous avons pu vérifier le caractère hydrophobe des supports et nous avons constaté qu’ils présentaient une fluorescence intrinsèque non négligeable, par ailleurs homogène. Bien que nous ne soyons pas parvenus à déterminer avec certitude leur recouvrement surfacique en fonctions amine, l’ordre de grandeur trouvé semble cependant correct (4,6.10-10 mol/cm2). Nous avons ensuite réalisé le greffage covalent de différents traceurs fluorescents sur ces supports. Nous avons utilisé 3 composés déjà étudiés au laboratoire pour d’autres applications :
- deux composés acides, notés CiCOOH et CouCOOH, activés sous forme d’esters de succinimidyle et greffés sur les lames silanisées par une liaison amide,
- un dérivé coumarine aldéhydique noté CouCHO, greffé via une liaison imine sur les supports.
Les greffages ont été analysés en spectrofluorimétrie : les analyses ont révélé que nous étions parvenus à greffer avec succès les 3 traceurs fluorescents sur les lames S ; leurs caractéristiques en excitation et en émission de fluorescence sont les suivantes :
λ λ λ λexc λλλλém CiCOOH 470 565 CouCOOH ≈ 410 ≈ 467 CouCHO 423 470 lames S 423 530
Etant donné que les deux traceurs fluorescents acides présentent des caractéristiques spectrales très distinctes (maxima en excitation et en émission, intensité de fluorescence), et
ce également par rapport aux supports commerciaux, et que par ailleurs leur greffage est réalisé dans les mêmes conditions (solution aqueuse de bicarbonate de sodium à pH 8,5), ils ont été retenus pour l’étude de la localisation des greffages (partie D). Le composé CouCHO sera lui utilisé pour contrôler les différentes étapes entrant dans la préparation des supports fonctionnalisés (partie E).
Après avoir démontré qu’il était possible de réaliser des greffages covalents sur les supports commerciaux, nous allons à présent étudier leur localisation. Nous avons opté pour une méthode utilisant la stéréolithographie et qui consiste à isoler les greffages à l’intérieur de puits physiques en polymère. Les polymérisations vont être réalisées à même les supports après étalement d’une résine liquide hydrophobe, ce qui est rendu possible par le caractère hydrophobe des lames utilisées.
Nous avons également développé une variante à cette méthode, qui a pour principe de protéger temporairement avec un polymère certains sites réactionnels bien définis, au niveau desquels les greffages pourront être réalisés ultérieurement. Cette étude va faire l’objet de la prochaine partie.
3ème partie : Partie C
C
C.. LLOOCCAALLIISSAATTIIOONN DDEESS SSIITTEESS
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Introduction
Ce travail a pour objet la réalisation de greffages covalents et localisés de molécules biologiques sur des supports plans. La localisation des greffages sous-tend une miniaturisation des systèmes étudiés, les sites réactionnels ainsi "isolés" pouvant être assimilés à des mini réacteurs. Ces mini réacteurs étant indépendants les uns des autres, ils sont le siège de réactions qui leur sont propres, et différentes réactions peuvent alors être conduites sur un même support. Il sera alors permis d’analyser différentes interactions biologiques de type sonde/cible sur une même plaque. Par ailleurs, du fait de la miniaturisation, les quantités des réactifs mis en jeu pour élaborer ce biocapteur seront diminuées, ainsi que les volumes des échantillons soumis à l’analyse. Enfin, si nous parvenons à contrôler parfaitement la localisation des sites réactionnels sur les lames, il sera alors aisé d’adapter ces supports aux systèmes automatisés déjà existants de dépôt des échantillons et/ou de détection des réactions spécifiques se produisant au niveau de ces sites.
Nous allons dans cette partie décrire les méthodes de localisation employées : elles sont basées sur la polymérisation à même les supports d’une résine photosensible, pour former des puits ou des plots en polymère. Ceci est réalisé grâce à la stéréolithographie, technique qui permet de polymériser localement une résine par irradiation laser. Afin de quantifier la précision des motifs réalisés, les résultats de nos expériences seront analysés par profilométrie optique.
C.I. Mise en oeuvre de la stéréolithographie
Le terme lithographie, qui vient de lithos (pierre) et de graphie (dessin), désigne l’art de reproduire par impression les dessins tracés avec une encre ou un crayon gras sur une pierre calcaire. La stéréophonie étant une technique de reconstitution spatiale (de source sonore), son mariage avec la lithographie est tout d’abord un rapprochement entre l’art et la technique. La stéréolithographie (SL) est une technique relativement récente: elle a été développée quasi-simultanément par Hull (1984) aux Etats-Unis et André et al. (1984) au laboratoire. C'est le début du prototypage rapide par photofabrication 3D résolue spatialement.
La stéréolithographie a pour principe la polymérisation localisée dans l'espace d'une résine liquide en un polymère solide, sous l'action d'une source d'énergie lumineuse. Le procédé classique, maintenant largement industrialisé, permet de fabriquer des objets volumiques de formes complexes, par une méthode additive de couches. Il permet de travailler avec des temps de fabrication courts et suivant un processus totalement informatisé et automatique, depuis la conception assistée par ordinateur (CAO), jusqu'à la réalisation effective de l’objet. L'évolution majeure de cette technique consiste maintenant à réaliser des pièces fonctionnelles et plus précises. C'est pourquoi, cette technologie sensible a depuis connu de nombreux développements soit en terme de matériau [Hinczewski et al., 1998 ; Dufaud & Corbel, 2002], soit en terme de procédé, en allant vers la miniaturisation et le procédé de microstéréolithographie [Monneret et al., 2002]. Il semble donc très intéressant de développer le procédé de stéréolithographie à l’échelle de la microfabrication, pour subvenir aux besoins toujours plus grands de pièces miniatures complexes, que les techniques de microfabrication basées sur l’emploi du silicium ne peuvent pas forcément produire.