Cette méthode consiste à localiser les greffages au niveau des sites –NH2 protégés par le polymère. Il convient au préalable de protéger chimiquement toutes les autres fonctions amine présentes sur la surface du support, même s’il est probable que la réaction ne soit pas strictement localisée à l’extérieur des plots, compte tenu de la perméabilité du polymère. Avant toutes choses, il s’agit de vérifier qu’il est possible de réaliser des greffages à l’emplacement des plots, une fois le polymère ôté du support.
D.III.1.Etude de la réactivité des sites –NH
2protégés par le polymère
Nous avons polymérisé sur une lame S deux plots mesurant 18 mm de diamètre (dth) et distants bords à bords de 2 mm. Après les avoir décollés du support en immergeant la plaque dans du DMF, nous avons greffé le cinnamilydène sur toute cette surface (celle sur laquelle ont été réalisées les polymérisations), en procédant par mouillage pour pouvoir comparer les résultats du greffage entre l’intérieur et l’extérieur des plots. La lame est soigneusement rincée, puis analysée au spectrofluorimètre :
Figure 90 Greffage par mouillage de CiNHS sur toute la face polymérisée
Analyse au spectrofluorimètre
Nous avons en réalité mesuré la fluorescence en 4 points à l’intérieur de chaque plot (soit 10 mesures au total) : étant donné que le signal est homogène au niveau du polymère, pour ne pas surcharger les graphes, nous ne présenterons ici que les spectres correspondant aux mesures 1 à 6 reportées sur la figure 90 ; les autres courbes sont jointes en annexe (Annexe 5).
Figure 91 CiNHS greffé par mouillage sur toute la surface polymérisée (plots décollés) Spectres d’émission de fluorescence (λexc = 470 nm, mode Sc/Rc, f = 3 nm)
Nous avons également reporté sur cette figure le spectre d’une plaque S vierge, mesuré dans les mêmes conditions.
On remarque que le traceur CiNHS s’est greffé sur toute la surface du support, aussi bien à l’intérieur qu’à l’extérieur des plots. On détecte cependant moins de signal au niveau des plots, ce qui semble indiquer qu’on ne récupère pas toutes les fonctions amines protégées par le polymère. Après avoir soustrait le signal de la plaque des spectres 1 à 6, on trouve par le calcul que le greffage à l’emplacement des plots représente 65 % du recouvrement sur le reste de la surface. Environ un tiers des fonctions amines initialement présentes sur cette surface ont donc été perdues. Etant donné que ces supports sont préparés en vue de réaliser le greffage covalent d’anticorps qui sont des molécules très encombrées, le taux de recouvrement effectif sur les supports, rapporté à la densité surfacique des lames, sera dans tous les cas faible en proportion.
D.III.2.Protection chimique des fonctions amine
Pour protéger chimiquement les fonctions amine libres présentes sur la surface du support, nous avons choisi d’y greffer l’acide dodécanoïque via une liaison amide, après l’avoir au préalable activé avec le N-hydroxysuccinimide.
D.III.2.1.Activation de l’acide dodécanoïque par le NHS et greffage sur les supports
L’activation de l’acide dodécanoïque sous forme d’ester de succinimidyle est réalisée suivant le protocole appliqué aux traceurs fluorescents acides (CiCOOH et CouCOOH), qui est décrit dans la deuxième partie (§ B.V.4.1. et B.V.4.2.).
Son greffage sur les supports est de la même manière réalisé dans une solution de bicarbonate de sodium à pH 8,5. L’acide activé s’est révélé être très peu soluble en milieu aqueux. Nous avons malgré tout immergé 3 plaques S dans cette solution, et nous avons laissé réagir, à température ambiante et sous agitation magnétique, durant 3 h, 6 h et 24 h, après quoi les plaques ont été soigneusement rincées.
D.III.2.2.Validation du "capping" chimique
Nous avons ensuite greffé CouCHO sur ces 3 plaques, afin de déterminer si le capping a ou non, réussi : si nous ne détectons aucun signal de CouCHO sur les supports, nous pourrons alors en déduire que l’acide dodécanoïque a bien été greffé sur toute la surface.
Le greffage de CouCHO sur les supports a été réalisé comme décrit dans la deuxième partie (partie B, § B.V.3.1.). Pour chacune des plaques, la fluorescence a été mesurée en huit points. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 92, sur laquelle nous avons également reporté le signal d’une lame S vierge greffée avec ce même traceur.
Figure 92 Protection chimique des –NH2 par l’acide dodécanoïque : plaques testées avec CouCHO Spectres d’émission de fluorescence (λexc = 423 nm, mode Sc/Rc, f = 3 nm)
Nous avons reporté sur la figure 92 les spectres de fluorescence moyens obtenus pour chacune des trois plaques, ainsi que la dispersion autour de la valeur moyenne, mesurée au maximum de fluorescence, à 470 nm.
Après 3 h de capping, les spectres réalisés sont similaires à ceux d’une lame S vierge greffée avec CouCHO : à ce stade de la réaction, le greffage de l’acide dodécanoïque sur le support est peu visible. Le greffage est par ailleurs très inhomogène sur toute la longueur de la plaque (42 % d’écart maximum !).
Après 6 h et 24 h, on détecte encore la fluorescence de CouCHO, mais bien moins qu’après 3 h : cette fluorescence résiduelle représente 21 % après 6 h, et 19 % après 24 h. Le greffage de CouCHO sur les supports est donc réduit d’environ 80 % lorsque le capping est réalisé avec succès, soit au bout de 6 h ; en effet, les résultats obtenus ne sont pas significativement meilleurs après 24 h. On remarque par ailleurs que dans ce cas, le signal reste faiblement dispersé : ceci indique que le greffage de l’acide dodécanoïque est homogène sur toute la surface des supports.
Nous avons renouvelé l’expérience avec d’autres lames S vierges qui ont été immergées dans le même milieu que précédemment pendant 6 h. Les résultats n'ont pas été reproductibles : le greffage du bras n'a été observé que dans un cas sur deux.
Nous avons également testé une méthode classique de protection chimique des fonctions amines décrite dans la littérature [G. Grandjean et al., 2002], faisant intervenir l’anhydride acétique : les résultats obtenus n’ont pas été plus reproductibles que dans le cas précédent.
A ce stade de l’étude, nous n’avons pas d’explications permettant de justifier ces échecs, d’autant que nous sommes parvenus à acyler les supports avec d’autres composés similaires, tels que l’anhydride succinique (cf. partie E, § E.II.1.) ou les esters de succinimidyle des traceurs fluorescents.