CHAPITRE 5 EXPERIMENTATIONS EX VIVO
A. ii Tests d’électrostimulation
Les expériences suivantes ont consisté à appliquer un champ électrique entre deux électrodes métalliques (acier inoxydable, cf. Chapitre 2 – Protocole 1). Pour délivrer les impulsions électriques, les électrodes sont reliées à un générateur de tension tel que décrit dans le
chapitre 2. Les électrodes sont distantes de 0,4 cm l’une de l’autre.
Deux expériences différentes ont alors été menées ; l’une consiste à appliquer le champ électrique en présence de la solution de Dextran-FITC déposée entre les électrodes, alors que dans l’autre, la solution de Dextran-FITC est ajoutée après l’application des impulsions électriques. Le tableau ci-dessous décrit les paramètres électriques utilisés pour les expériences d’électrostimulation.
Tableau 5-1 : Paramètres expérimentaux utilisés lors des expériences ex-vivo U (positif) volt U (négatif) volt T (positif) (ms) T intermédiaire (ms) P (seconde) R Distance Inter- électrode (cm) Champ électrique (V/cm) 300 0 20 0,010 1 10 0,4 120
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a. Electrostimulation en présence de la solution de Dextran-FITC
La Figure 5-2 montre les résultats obtenus avec les paramètres électriques utilisés (voirtableau 5-1) lorsque la solution de Dextran-FITC est laissée en contact 30 minutes après
l’électrostimulation. Avant l'observation en microscopie à fluorescence, un papier absorbant imbibé de PBS est doucement appliqué pour éliminer l’excès de solution de Dextran-FITC non adsorbée sur la peau.
❒ Observations en microscopie à fluorescence
On peut observer (Fig.5-2(a)) un marquage fluorescent qui correspond à l’endroit où a été déposée la solution de Dextran-FITC. Au niveau de la cathode, on remarque une très légère marque laissée par l’électrode utilisée. De l'autre côté, à l’anode aucun changement significatif n’est observable ; le marquage n'est que très superficiel (seuls les poils sont marqués) comme en l’absence de champ électrique. La Figure 5-2(b) montre plus précisément la structure de surface de la peau coté cathode. En effet, outre les poils, on observe clairement que la molécule fluorescente révèle des amas fluorescents principalement constitués de peaux mortes superposées. On peut observer que la solution n’a pas ou très peu pénétré au travers du stratum corneum et que le marquage n’est que superficiel. De plus, il semblerait que dans cette configuration, il n’y ait pas d’altération significative de la peau (du moins visible en microscopie à fluorescence).
Figure 5-2 : Visualisation par microscopie à fluorescence à différents grandissements de la peau de souris Nude après 30 minutes de contact avec 100 µL de Dextran-FITC (1 mM) avec stimulation électrique ; (a) Image de la surface de la peau exposée au champ électrique (cathode et anode). (b) agrandissement en surface de la cathode ; (c) Zoom numérique X400 de la cathode.
Dans cette configuration, la structure de la peau ne semble pas significativement modifiée ni même altérée. En effet, dans cette configuration expérimentale, le champ électrique passe préférentiellement à travers le liquide (PBS) et de ce fait n’interagit que très modérément avec la peau.
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b. Dépôt de la solution de Dextran-FITC après électrostimulation
Dans cette configuration, la solution de Dextran-FITC est déposée juste après l’application des trains d’impulsions (Tab.5-1), et laissée pendant 30 minutes comme précédemment. Avant l'observation en microscopie à fluorescence, un papier absorbant imbibé de PBS est doucement appliqué pour absorber la solution de Dextran-FITC en excès à la surface de la peau.❒ Observations en microscopie à fluorescence
La Figure 5-3 présente des marquages fluorescents visibles au niveau de la peau de souris après électrostimulation. Ces marques sont présentes au niveau des électrodes et plus nettement au niveau de la cathode. Dans ce cas, l’empreinte laissée est très intense. De plus, la forme des électrodes est très distincte, ce qui montre l’effet plus prononcé du champ électrique sur la peau. On peut observer de nombreux points intensément fluorescents répartis sur toute la surface. En particulier, une zone très intense indiquant une potentielle brûlure causée par le courant probablement trop élevé (effet de pointe – cf. Chapitre 2
(géométrie d’électrodes)) dans cette configuration. La forte intensité de fluorescence à cet
endroit semble due à l’introduction de la molécule fluorescente dans la lésion causée par le champ électrique. Par ailleurs, la surface où se situait l’anode ne met rien d'autre en évidence que l’imprégnation des poils par la solution fluorescente signe que l’anode ne provoque a priori aucun effet sur la peau.
Figure 5-3 : Visualisation par microscopie à fluorescence de la surface de la peau exposée au champ électrique illustrant le marquage du Dextran-FITC notamment du côté de la cathode. Le champ électrique est appliqué, puis 100 µl a 1 mM de Dextran-FITC sont déposés entre les électrodes.
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Les observations à plus fort grandissement de ces deux zones (anode, cathode), permettent de détailler la morphologie de surface de la peau (Figure 5-4(a, b)). On note la présence (cathode) d'amas cellulaires (cellules mortes observées précédemment), des rides ou sillons répartis à la surface de la peau, et certains follicules pileux (base des poils). La zone située sous l’anode illustrée en Figure 5-4(b) ne montre, comme précédemment, aucun signe distinctif de pénétration de la molécule fluorescente.
Figure 5-4 : Visualisation par microscopie à fluorescence à différents grandissements illustrant le marquage du Dextran-FITC sous l’effet du champ électrique au niveau de la peau sous les électrodes : (a) à la cathode ; (b) à l’anode ; (c) zoom numérique X400 à la cathode; (d) zoom numérique X400 à l’anode.
Ces expériences nous permettent de mettre en évidence les limites d’utilisation de ce type d’électrodes pour la délivrance transdermique de molécules. Par ailleurs, des brulures liées à forte intensité du champ électrique333,334 peuvent être possibles332. Ces expériences préliminaires montrent que dans le cas d'électrodes métalliques et dans cette configuration expérimentale, un marquage plus prononcé se produit uniquement au niveau de la cathode.
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