ii Avec stimulation électrique

Afin de vérifier que nos dispositifs permettent de perméabiliser la peau et également de délivrer la molécule d’intérêt, ils ont été soumis aux impulsions électriques (précédemment

décrites) puis laissés pendant 30 min sur la peau avant la visualisation en microscopie à

fluorescence. Comme précédemment, un papier absorbant imbibé de PBS est doucement appliqué pour absorber l’excès de Dextran-FITC déposé sur la peau.

❒ Observations en microscopie à fluorescence

La Figure 5-6 présente des images illustrant le marquage du Dextran-FITC au niveau de la position des hydrogels. La Figure 5-6(a, a’, a’’) et la Figure 5-6 (b, b’, b’’) présentent respectivement les échantillons CTRL-AG et DWNT-AG et compare également les expériences avec ou sans champ électrique.

En absence de champ électrique, (Figure 5-6 (a, b) identique à la Figure 5-5(a) mais étalonnée aux mêmes valeurs d’intensité de contraste de fluorescence que les expériences après électrostimulation Fig.5-6(a’, b’)), aucune fluorescence n’est observée ce qui confirme nos résultats précédents ainsi que ceux de la littérature, démontrant que l’application d’un champ électrique est nécessaire pour la perméabilisation du stratum corneum (SC).

La Figure 5-6 (a’, b’) montre 2 marques circulaires fluorescentes correspondant respectivement à la cathode et à l’anode. Pour l’échantillon CTRL-AG (Fig.5- 6(b’)), on remarque une marque intense au niveau de la cathode démontrant le relargage de la molécule depuis le matériau vers la peau. De plus, on peut observer une marque continue sur tout le pourtour du disque. Cette marque pourrait provenir des dentelures observées sur les bords de l’hydrogel lorsque celui-ci est découpé à l'emporte-pièce selon le protocole décrit au

chapitre 3. Ces inhomogénéités amplifiées lorsque l’hydrogel regonfle peuvent provoquer un

effet de pointe à ces endroits lorsque le champ électrique est appliqué. Il semblerait que ces effets favorisent la perméabilisation de la peau (très localement) et le relargage de la molécule sur le pourtour du dispositif.

On peut aussi remarquer que le centre du disque présente dans tous les cas une intensité de fluorescence bien inférieure à celle du pourtour notamment à certains endroits (délimités en

pointillés sur la Fig.5-6). Ceci pourrait s’expliquer par un contact matériau/peau amoindri dans

cette zone ou encore un champ électrique plus faible du fait des aspérités (ou renflements) de la peau. L'observation principale est que la fluorescence est absente du côté de l’anode. En ce qui concerne l’échantillon DWNT-AG (Fig.5-6(b’)), on remarque que l’intensité de fluorescence est bien supérieure à celle de l’échantillon CTRL-AG. Effectivement, le disque fluorescent (coté cathode) est beaucoup plus prononcé également sur tout son pourtour mais également du côté en regard avec l’anode. Cette zone est située à l’endroit où le champ électrique est le plus intense et donc où le SC a le plus de probabilité d’être perméabilisé. De plus, on peut remarquer des sortes de plis de moindre fluorescence au niveau de l’anode,

190

indiquant soit un champ électrique moins élevé à certains endroits, soit des problèmes de contact à l’interface peau / hydrogel nanocomposite). Selon l’équation du champ électrique

E=V /d (en V.cm-1_{), lorsque la distance inter-électrode diminue, l’amplitude du champ E} augmente. Si E augmente, d’une part la surface perméabilisée des cellules augmente (et donc

la surface de perméabilisation180,198_{) et d’autre part la force électrophorétique appliquée sur} les molécules chargées augmente. Ainsi les molécules chargées pourront migrer plus facilement.

Les Figures 5-6(a’’, b’’) montrent un agrandissement sur une zone fluorescente de la surface de la peau. Les sillons et les follicules pileux sont très contrastés et facilement discernables. Par ailleurs, on peut également observer de nouvelles structures ayant une forme hexagonale

(encadré en Fig.5-6 (a’’, b’’)), montrant l’insertion de la molécule fluorescente au travers du

SC. Ces formes d’hexagones semblables à des nids d’abeilles à la surface de la peau représentent différentes strates lipidiques du SC formées de kératinocytes morts, dont le noyau est absent. Les mesures quantitatives de fluorescence effectuées sur la Figure 5-6(a’’,

b’’) présentent un niveau de fluorescence moyen de 2400 u.a. (unité arbitraire) pour

l’échantillon CTRL-AG contre 5000 u.a. pour l’échantillon DWNT-AG soit environ un facteur 2. A fort grossissement, il est visible que les molécules ne sont pas uniformément reparties (sont

indiquées par des pointillés blancs les zones où le passage de molécules est défavorable). Ceci

illustre bien l’inhomogénéité de la peau et la création de chemins préférentiels au travers du SC lors de l’application du champ électrique.

191

Figure 5-6 : Visualisation par microscopie à fluorescence à différents grandissements de la peau de souris Nude lorsque les échantillons contenant du Dextran-FITC sont déposés à la surface de la peau. ; (a, a’, a’’) concerne les hydrogels CTRL-AG et (b, b’, b’’) les hydrogels DWNT-AG. ; (a) et (b) représentent les hydrogels sans stimulation électrique au même niveau d’intensité que les images (a’, b’’) – (a’, a’’) et (b’, b’’(filtre à 25%) coté cathode) représentent les échantillons avec stimulation électrique, à deux grandissements différents ; (a’’’) zoom numérique X400 et (b’’’) zoom numérique X400.

Ces expériences démontrent donc la faisabilité de notre approche, mais également les difficultés auxquelles nous seront confrontées pour la suite des travaux afin de parfaire ces dispositifs. En effet, la possibilité d'utiliser des hydrogels nanocomposites contenant des nanotubes de carbone pour la délivrance transdermique de molécule semble être en partie

192 atteinte. Toutefois, ces résultats sont préliminaires et nécessitent encore de nombreux efforts et expériences complémentaires afin de mieux comprendre notre matériau et notamment les interactions dispositif/champ électrique/peau.

a. Reproductibilité

Chaque souris possède une peau présentant des caractéristiques variables (épaisseur,

hydratation, pilosité,…). Ainsi, la perméabilité de la peau peut varier en fonction de l'animal

et de la zone mise en œuvre. De plus, l’animal peut se gratter, se battre avec ses congénères et avoir ainsi des lésions cutanées qui seront des zones plus sensibles que les autres. C’est pour ces raisons que de nombreuses expériences sur peau de souris sont nécessaires afin d’obtenir un nombre d’observations suffisant pour une étude statistique complète.

❒ Observations en microscopie à fluorescence

La Figure 5-7 présente les tests d’électrostimulation concernant les échantillons CTRL-AG (Fig.5-7(a, a’’)) et DWNT-AG (Fig.5-7(b, b’’)) réalisés dans les mêmes conditions expérimentales que les précédentes. Nous confirmons les mêmes caractéristiques concernant l’intensité du signal de fluorescence (intensité de fluorescence CTRL-AG < intensité de

fluorescence DWNT-AG). La Figure 5- 7(a’’, b’’) illustre très clairement l’apparition des zones

en nids d’abeille également observées lors de l’expérience précédente, montrant la pénétration de la molécule pharmacologique dans différentes strates du SC. On remarque également une meilleure homogénéité de la fluorescence du Dextran-FITC pouvant être attribuée à un meilleur contact entre le dispositif et la surface de la peau.

Il faut noter aussi que les marques fluorescentes de l’anode et la cathode sont plus rapprochées, contrairement aux expériences précédentes. Ceci est dû à la stimulation des muscles peauciers provoquant la contraction de la peau (en survie) et engendrant de ce fait le rapprochement des électrodes. Ce phénomène apparait lors des stimulations électriques et s’accentue avec le nombre d’impulsions délivrées. Ce phénomène est directement relié à la contraction de la peau, qui dépend de l'intensité du champ électrique.

L’échantillon DWNT-AG présente également ce phénomène de contraction qui était moins visible sur les expériences précédentes. Dans tous les cas, les paramètres électriques doivent être adaptés de manière à prévenir toute mise en contact des deux électrodes. Ce contact provoque un court-circuit (les lignes de champ ne passent plus dans la peau). Les mesures quantitatives de fluorescence effectuées sur la Figure 5-7(a’’, b’’) présentent un niveau de fluorescence moyen de 2500 u.a. pour l’échantillon CTRL-AG contre 5000 u.a. pour l’échantillon DWNT-AG soit un facteur 2.

193

Figure 5-7 : Visualisation par microscopie à fluorescence à différents grandissements de la peau de souris Nude lorsque les échantillons contenant du Dextran-FITC sont déposés à la surface de la peau pour les échantillons CTRL-AG (a, a’,) et DWNT-AG (b, b’) avec stimulation électrique - (a) et (b) représentent les échantillons à faible grandissement illustrant les marques à la cathode et à l’anode. (a’, b’) représente un agrandissement au niveau la cathode au même niveau d’intensité ; (a’’) zoom numérique X400 ; (b’’) zoom numérique X400.

Vu le caractère exploratoire de cette étude, la mise en place de protocoles ou d’expériences permettant de quantifier le nombre de molécules fluorescentes diffusées ou encore de déterminer la profondeur de pénétration nécessitera de nombreux travaux supplémentaires notamment par des mesures sur des coupes histologiques. Les expériences réalisées dans cette étude n’ont jamais été décrites dans la littérature. Ainsi, nous ne disposons pas de références pour comparer nos résultats.

Par ailleurs, les paramètres sélectionnés pour ces expériences ne sont pas optimisés pour l’utilisation de ce dispositif. En effet, l’idée est de provoquer la perméabilisation temporaire de la peau, puis une fois cet état atteint, d’utiliser des tensions plus faibles permettant de favoriser l’électrophorèse. Typiquement, il conviendrait d’appliquer des trains d’impulsions de très fortes tensions de l’ordre du kV pendant des temps très courts, de l’ordre de la µs, puis de diminuer la tension à des gammes comprises entre 10 et 50 V et des durées plus longues (de l’ordre de la ms ou s) pour favoriser le régime électrophorétique de la macromolécule.

194