Identification macroscopique et microscopique

L’identification macroscopique des isolats a été d’abord réalisée à l’œil nu, en se basant sur la couleur et l’aspect de la colonie sur différents milieux de culture, puis au microscope en fonction de l’aspect morphologique cellulaire. Les isolats fongiques d’Aspergillus de

Penicillium, ont été observées macroscopiquement et microscopiquement puis classés selon la

taxonomie de Pitt (1999) en section Flavi, Nigri et Circumdati (Figure 21).

Figure 21. Identification macroscopique et microscopique selon Pitt et Hocking (1999). a : Section Flavi; b : Section Nigri et c : Penicilllium spp. (Culture de 7 jours sur milieu PDA à 25°C)

L’observation des colonies a été réalisée après croissance sur milieu YES (Pitt et Hocking., 1999). Par ailleurs, eu égard à l’hétérogénéité des espèces appartenant au groupe des

Aspergillus section Nigri, qui pourrait dissimuler quelques spécimens ochratoxinogènes

potentiellement dangereux, plusieurs études se sont alors intéressées à ce groupe pour mieux clarifier sa taxonomie et différencier ses espèces pour l’étude de sa taxonomie. Abarca et al. (1994), ont montré que les espèces non communes sont au nombre de 3, soit les A. helicothrix, les A. ellipticus et les A. heteromorphus. Ainsi, les auteurs ont proposé la clef d’identification simple pour connaître les grands groupes des black aspergilli en excluant les formes non communes (Tableau 7 ; Figure 22). Ces espèces sont caractérisées par des colonies de couleur

b. a.

brun foncé à noir. Pour élaborer les préparations microscopiques, on ajoute une goutte de bleu de méthylène (1%) sur une lame grâce à une pipette Pasteur. Sur les boîtes de culture, les parties fongiques les plus jeunes qui se trouvent au bord de la colonie (une culture de 2 à 3 jours) sont prélevées grâce à une aiguille stérile. Ensuite les parties isolées sont disposées sur la lame et mélangées avec le bleu de méthylène. On pose ensuite la lamelle dessus et on observe les préparations au microscope (grossissement ×100, ×400, ×1000).

Figure 22. Aspect des conidiophores et des conidies des espèces de black Aspergilli

a: Conidiophore d’Aspergillus Uniserié : a.1 Tête conidienne; a.2 Conidie=A.

japonicus/A.aleucus. b: Conidiophore d’Aspergillus Biserié : b.1 Tête conidienne et b.2

Conidie > 6 µm = A. carbonarius ; b.3 Tête conidienne et b.4 Conidie < 6 µm = A. niger

Aspergilli unisériée A. japonicus/A. aculeatus a Aspergilli bisériée 2^b

* Si le diamètre des conidies est supérieur à 6 μm A. carbonarius * Si le diamètre des conidies est inférieur à 6 μm A. niger aggregate ^c

a Le fait de savoir si A. japonicus et A. aculeatus sont une ou deux espèces est encore en question.

b A. helicothrix, A. ellipticus et A. heteromorphus ne sont pas inclus car ce sont des espèces très rares.

c Les études moléculaires indiquent que le groupe A. niger aggregate peut être divisé en deux, trois ou quatre taxons selon différents auteurs. La distinction entre ces taxons est impossible morphologiquement.

Tableau 7. Clé d’identification des black aspergilli. (Abarca et al., (2004)

Les isolats de Fusarium ont été observés macroscopiquement et microscopiquement sur milieu PDA et SNA, respectivement. Les isolats ont été classés par espèce selon les différents critères d'identification selon la taxonomie de Nelson et al., (1983) (Figure 23).

Par ailleurs, les isolats d’Alternaria ont été observés macroscopiquement et microscopiquement sur milieu PCA. L'identification des espèces d'Alternaria a été réalisée à travers le type de sporulation selon la taxonomie de Simmons (2007) (Figure 24). Les différentes souches de champignons ont été conservées à -20°C dans des tubes cryogéniques de 1,5 ml sous formes de suspensions préparées dans une solution d’eau/ glycérol 40% (4/10 ; v/v). La fréquence et la densité relative des genres et des espèces contaminant le millet perlé ont été calculées selon les formules de Marasas et al., (1988a) :

Fréquence (%) = nombre d’échantillons contaminés par un genre ou une espèce x 100

nombre total des échantillons

Densité relative (%) = nombre d’isolats d’un genre ou d’une espèce x 100 nombre total des genres ou espèces isolées

Figure 23. Identification macroscopique et microscopique selon la taxonomie de Nelson et al. (1983). a : Fusarium semitectum ; b : F. equisiti (Culture de 10 jours sur milieu SNA à 21°C)

Figure 24. Identification macroscopique et microscopique selon la taxonomie de E. G. Simmons (2007). a : Alternaria alternata; b : A. infectoria; c : A. tenuissima ; d : A.

arborescens. (Culture de 7 jours sur milieu PCA à 25°C)

a. _b.

a b

.

c

.

d

.

2.2. Identification moléculaire

Une caractérisation moléculaire d’une sélection d’isolats fongiques toxinogènes appartenant aux genres Fusarium, Alternaria et Aspergillus a été réalisée moyennant une amplification et un séquençage de la région ITS1-5.8S-ITS2 de l'ADN ribosomal.

2.2.1. Extraction de l’ADN fongique

L’extraction de l’ADN fongique a été réalisée à partir du mycélium issu de souches fongiques cultivées sur milieu PDA pendant 7 jours à 25°C. Pour ce faire, 150 mg du mycélium ont été transférés dans un tube Eppendorf 2 ml avec 0,3g de billes de verres de 0,1 mm de diamètre. Une lyse chimique a été réalisée par l’addition de 550 µL de tampon de lyse SDS (0,2M TrisHCL, pH=8 ; 10 mM EDTA, pH=8 ; 0,5 M NaCl ; 1% SDS) dans chaque tube suivi d’un vortex pendant 5 min. Par la suite, 275 µL d’acétate de potassium (7,5M) ont été ajoutés suivi d’une incubation pendant 10 min dans la glace. Après centrifugation (15 min, 13000 rpm, 4°C), le surnageant a été purifié à l'aide d’isopropanol froid (1 volume). Le mélange a été incubé pendant 12h à 4°C. Pour précipiter l’ADN, une centrifugation de 20 min à 13000 rpm a été réalisée. Pour laver le culot, un volume de 400 µL d’éthanol absolu froid a été ajouté. Le culot obtenu par centrifugation (15 min, 13000 rpm) a été récupéré, séché, puis resuspendu dans 100μL d'eau ultra pure. Les ADN ont été conservés à -20 °C jusqu’à analyse. Le dosage et le contrôle de la qualité des ADN extraits ont été réalisés par un Nanodrop (ND-8000). Les rapports des DO (260 nm/280 nm et 260 nm/230 nm) ont permis d’évaluer la qualité des échantillons.

2.2.2. Amplification PCR

Les amorces ITS4 (5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’) et ITS6 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) ont été utilisées pour amplifier la région ITS1-5.8S-ITS2 de l’ADN ribosomal. Les PCR ont été réalisées dans un volume final de 25 μl (4 µL chaque amorce

(5µM), 5 µL tampon (5 X), 0,5 µL dNTP (10 mM), 0,2 µL Go Taq (5U/µL), 1 µL MgCl2 (25

mM), 1 µL ADN (10 ng ADN), H2O qsp 25 µL). Les amplifications ont été réalisées dans un

thermocycleur Gene Amp PCR-system 9700 (Applied Biosystems) suivant le programme suivant : dénaturation initiale 5 min 95 °C, 35 cycles de dénaturation 30 sec à 94°C ; 30 sec à 54°C ; 40 sec à 72°C ; et une élongation finale 5 min 72°C. La révélation de la séquence amplifiée a été réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose TAE à 2%. Après une migration pendant 40 min à 100 V, les produits de PCR ont été quantifiés par comparaison avec le marqueur de poids moléculaire 100 pb DNA Ladder (Proméga). La taille du produit PCR attendue est de 600pb.

2.2.3. Séquençage du produit d’amplification PCR

Afin d’identifier les espèces fongiques un séquençage des produits PCR positifs ont été envoyés à un prestataire externe Génome Express (https://www.gexbyweb.com). Le séquençage des fragments d’intérêt a été réalisé par l’amorce ITS4 (5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’). Les séquences obtenues sont ensuite analysées par comparaison avec des séquences existant dans les bases de données (GenBank) à l’aide du programme Blast du serveur NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Les alignements des séquences sont effectués avec le logiciel ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Seules les séquences ayant un pourcentage d’identité supérieur à 98% ont été retenues.