1.1. Optimisation de l’extraction d’ADN fongique
Trois protocoles d’extraction d’ADN fongique à partir du millet perlé ont été testés en se basant sur différents tampons de lyse, à savoir le triton X-100, le CTAB et le SDS. L’extraction des deux premiers protocoles a été effectuée à partir d’une solution peptonée du
millet alors que pour le troisième protocole, l’extraction a été t réalisée directement à partir du millet.
1.1.1. Tampon de lyse Triton X-100
Pour ce faire, un total de 20 g de millet a été broyé avec un mixeur puis 10 g ont été
homogénéisés dans 90 ml d'une solution peptonée (0,1%) pendant 30 minutes. L’extraction a été réalisée à partir du culot obtenu après centrifugation (13000 rpm, 10 min) d'un aliquot de 1 ml de la solution peptonée (+ 0,3 g de billes de verres) par 300 µL de tampon de lyse (2% triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH8). Après 5 min d’incubation, 100 µL de Tris-EDTA et 100 µL de lysozyme (25 mg/ml) ont été additionnés. Après une incubation pendant 5 min à température ambiante, 100 µL de protéinase K (20 mg/ml) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé au bain marie pendant 20 min à 42°C. Par la suite, 50 µL de SDS (20%) ont été additionnés puis incubés à température ambiante pendant 5 min suivi d’une incubation à 42°C pendant 10 min. Ensuite, 400 µL de la solution CTAB (CTAB 2%, NaCl 3M) ont été ajoutés et incubés à 65°C pendant 10 min. Après incubation, une extraction phénol- chloroform a été réalisée en 2 répétitions. 700 µL de solution phénol (Phenol , CHCl3, IAA ; 25:24:1, v/v/v) ont été additionnés. Après une agitation manuelle suivie d’une centrifugation de 13000 rpm pendant 15 min, la phase supérieure a été transférée dans un nouveau tube Eppendorf. Par la suite, un volume de 600 µL de solution chloroforme (IAA,CHCl3 ; 1:24, v/v) a été ajouté. Après agitation manuelle et centrifugation à 13000 rpm pendant 10 min, la phase supérieure a été transférée dans un nouvel tube Eppendorf. 30 µL d’acétate de sodium (NaOAc, 3M, pH 5) ont été additionnés. Après agitation manuelle, un volume d’isopropanol 100% a été ajouté. Après une nuit à -20°C suivie d’une centrifugation à 12000 pendant 30 min, le culot récupéré a été lavé en ajoutant 500 µL d’éthanol 70% puis centrifugé à 13000 rpm pendant 5 min. Après le séchage du culot sous la hotte, il a été re-suspendu dans 100 µL d’eau MilliQ et conservé à 4°C. La qualité et la quantité d’ADN extrait
a été vérifié en utilisant le Nanodrop. L’évaluation de la quantité d’ADN fongique isolé a été réalisée par une PCR quantitative moyennant les amorces fongiques universelles ITS1 et 5,8S.
1.1.2. Tampon de lyse CTAB
Selon Passone et al. (2010), 10 g de millet ont été broyé avec un et homogénéisés dans 90 ml d'une solution peptonée (0,1%) pendant 30 minutes. L’extraction a été réalisée à partir du culot obtenu après centrifugation (13000 rpm, 10 min) d'une aliquote de 1 ml de la solution peptonée (+ 0,3 g de billes de verres) par 500µL de tampon de lyse CTAB (100 mM Tris HCl, pH 7,5 ; 2% de CTAB ; 1,4 mM NaCl). Après incubation à 65°C pendant 60 min, 500 µL de solution phénol (Phenol , CHCl3, IAA ; 25:24:1, v/v/v) ont été additionnés suivie d’une homogénéisation et une centrifugation (13000 rpm pendant 10 min). La phase aqueuse a été précipitée avec 10 µL NaCl (5M) avec 2 volumes d’éthanol 100%. Après homogénéisation et centrifugation (13000 rpm pendant 10 min), le culot récupéré a été lavé avec de l’éthanol 70%, centrifugé, séché sous hotte puis resuspendu dans 100 µL d’eau MilliQ et conservé à 4°C. La qualité et la quantité d’ADN extrait ont été vérifiées en utilisant le Nanodrop. L’évaluation de la quantité d’ADN fongique isolé a été réalisée par une PCR quantitative moyennant les amorces fongiques universelles ITS1 et 5,8S.
1.1.3. Tampon de lyse SDS
L’extraction de l’ADN fongique a été réalisée directement à partir de 0,2 g de grain moulu par 1 ml de solution SDS (200 mM de Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 288 mM; 25 mM d'EDTA, pH 8,0; 0,5% de SDS) plus 0,3 g de billes de verres. Après homogénéisation et centrifugation (13000 rpm pendant 5 min), 250 µL d’acétate de potassium (3M) ont été additionnés à 750 µL du surnageant suivi d’une incubation dans la glace pendant 30 min. Après centrifugation à 13000 rpm pendant 15 min à 4°C, 700 µL du surnageant ont été transférés dans un nouveau tube Eppendorf et lavés avec 500 µL d’isopropanol froid. Après incubation pendant la nuit, une
centrifugation à 13000 rpm pendant 10 min a été effectuée. Par la suite le culot a été lavé par de l’isopropanol froid 70% et séché sous la hotte. Le culot a été resuspendu dans 100 µL d’eau MilliQ et conservé à 4°C. La qualité et la quantité d’ADN extrait ont été vérifiées en utilisant le Nanodrop. L’évaluation de la quantité d’ADN fongique isolé a été réalisée par une PCR quantitative moyennant les amorces fongiques universelles ITS1 et 5.8S.
2. Les Courbes Standards
Neuf dilutions en série d'ADN fongique pur des isolats d’A. flavus (0.22.3), A. alternata (R6), F. semitectum (F57) ont été utilisées pour obtenir la gamme étalon. Les valeurs de Ct ont été tracées par logarithme de la quantité de départ pour chaque dilution. Alors, les rendements d'amplification ont été calculés à partir des pentes de la courbes standard (Kubista et al, 2006).
3. Validation de la méthode par qPCR
Une inoculation artificielle a été réalisée afin de valider la capacité de l’approche qPCR à quantifier la flore fongique potentiellement toxinogène dans le millet perlé. Pour ce faire, 100 g de grains millet ont été désinfecté dans une solution d’hypochlorite de sodium (NaClO, 1,5%). Après séchage à 75 °C dans un four à air forcé, les grains de millet ont été homogénéisés et broyés en une poudre fine. 1 g de la farine de millet a été inoculé par 1 mL de dilutions sériées de 102, 103, 104, 105, 106 et 107 spores/mL de trois souches d’Aspergillus flavus, Fusarium
semitectum et Alternaria alternata, respectivement. Ces suspensions sporales ont été
préalablement préparées par la culture des trois souches pendant 7 jours sur milieu PDA. Les spores ont été par la suite filtrées par le biais d’un filtre 0,45 µm stérile. Les concentrations ont été mesurées par microscopie en utilisant une chambre de comptage Thoma. Les suspensions de spores ont été dilués si nécessaire. Pour le contrôle négatif, la farine du millet (1g) a été inoculé avec 1 mL d’eau MilliQ. L’inoculation a été réalisée en triplicata pour chaque concentration et incubée pendant 24h avant extraction de l’ADN fongique selon le protocole préalablement choisi.
Une courbe standard pour chacun des essais a été effectuée avec de l'ADN fongique pur. Une série de dilution de l’ADN fongique pur pour chaque genre fongique a été utilisé comme gamme étalon soit l’ADN de la souche d’A. flavus (O.22.3), d’A. alternata (R6) et F.
semitectum (F 57). La quantité d'ADN fongique a été calculée à partir des valeurs de seuil de
cycle (Ct) en utilisant la courbe standard.
4. Amplification par qPCR
Les amplifications ont été réalisées au moyen d’un thermocycleur Light Cycler® 480 (Roche, Allemagne). La détection et la quantification de la flore fongique toxinogène totale dans les échantillons de millet ont été réalisées moyennant les amorces universelles (5.8 S: 5’ CGC TGC GTT CTT CAT CG 3’ et ITS f1: 5’ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3‘) ciblant la région ITS1 – ADNr 5.8S de l’opéron codant pour l’ARN ribosomal et en utilisant comme référence une souche d'Aspergillus flavus.
Par ailleurs, la détection et la quantification absolue des Aspergillus flavus a été réalisé moyennant les amorces spécifiques FLAVIQI (5′ GTCGTCCCCTCTCCGG 3′) et FLAQ2 (5′ CTGGAAAAAGATTGATTTGCG 3′), ciblant la région ITS2 – ADNr 5.8S de l’opéron codant pour l’ARN ribosomal et en utilisant comme souche de référence une souche d'Aspergillus
flavus.
Pour les Alternaria la qPCR a été réalisée en utilisant les amorces spécifiques AltF (5’ TCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT3’) et AltR (5’ TTACTGACGCTGATTGCAATTACA 3’)ciblant la région ITS2 – ADNr 5.8S de l’opéron codant pour l’ARN ribosomal et en utilisant comme référence une souche d’Alternaria alternata.
En outre, la quantification des Fusarium par qPCR a été réalisée en utilisant les amorces spécifiques FusariumF (5’ CTCCCAAACCCCTGTGAACATAC 3’) et FusariumR (5’ CGGGCCGTCCCKTTTTAC 3’) ciblant la région ITS2 – ADNr 5.8S de l’opéron codant pour l’ARN ribosomal et en utilisant comme référence une souche de Fusarium semitectum.
Toutes les réactions de la PCR quantitative ont été réalisées en triplicata dans une plaque de 384 puits automatisée par la technique Labcyte Echo 555. Un volume final de 1,5 µL composé de 0,75 µL du mélange Light Cycler 480 SYBR Green I (Master 2X concentration, Roche diagnostics, Allemagne), 0,25 µL d’amorces (0,8 µM) et eau ultra pure ainsi que 0,5 µL d’ADN. Les tests qPCR ont été effectués en utilisant le programme standard suivant :
Une pré-incubation : 95°C pendant 10 min. Amplification : 95°C pendant 10 sec.
60°C pendant 20 sec. 45 cycles
72°C pendant 35 sec. Courbe de fusion : 95°C pendant 5 sec.
65°C pendant 1 min. 97°C pendant ∞ Refroidissement : 40°C pendant 30 sec
Les résultats ont été analysés avec le programme Light Cycler®480Sofware release 1.5.0.