B) Purification du composé F
III) Identification du composé E
Le composé E a été purifié à partir de la fraction CZNCA-IX ; 1.7 mg a ainsi été obtenu. Dans ce chapitre, la LC-FT/MS et les RMN ont été utilisées dans les mêmes conditions que celles décrites dans le chapitre 6, paragraphe I.
A) Résultats obtenus en FT/MS
1) Détermination de la formule brute
Les résultats de FT/MS présentés ici ont été enregistrés à partir de l’injection de 10 µL d’une solution acétonitrile/eau (15 % v/v) de concentration 10 mg/L en composé E.
Temps (min) 0 5 8 11 16 25 45 47 54 55 60 % de B 10 10 18 18 25 25 36 100 100 10 10
160
Le chromatogramme des ions totaux présente un seul pic au temps de rétention 2.69 min, tant en mode positif qu’en mode négatif. Le signal est plus intense en mode négatif.
Le spectre de masse, présenté à la figure 53, est constitué d’un ion quasi-moléculaire majoritaire monochargé à m/z 817 et d’un signal faible à m/z 931.
Figure 53 - Spectre de masse du composé E en mode négatif
L’encadré correspond au détail de ce spectre autour de l’ion de rapport m/z 817.
La mesure de la masse exacte permet de confirmer que la molécule E a pour formule brute C43H62O15 (écart de 0.61 ppm à la valeur théorique) ; il s’agit bien d’un isomère des QTT I et II.
Les ions à m/z 817 et m/z 931 correspondent respectivement aux espèces [M-H]- et [M+CF3COO]-.
Ces résultats confirment la pureté du composé E et ainsi l’efficacité de la purification effectuée au paragraphe III.A de ce chapitre.
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 817.40112 C43H61O15 -0.57644 ppm 931.39331 C45H62O17F3 -1.23204 ppm 817.5 818.5 819.5 820.5 0 50 100 817.40094 818.40424 819.40680 820.40967
161
2) Etude de la fragmentation
L’application d’une énergie HCD de 80 eV permet d’enregistrer, en mode négatif, des fragments similaires à ceux observés pour le QTT I et II, notamment les ions de rapport m/z 169, 503, 593, 611 et 655 (figure 54).
Ces résultats suggèrent donc la présence d’un groupement galloyle et d’un hexose dans la molécule, le processus de fragmentation étant similaire à ceux des QTT I et II.
Figure 54 - Spectre de fragmentation en mode négatif du composé E par application d’une énergie HCD de 80 eV.
B) Résultats obtenus en RMN
Environ 1.5 mg du composé E a été dissous dans du méthanol deutéré, placé dans un tube de 3 mm et analysé à l’aide du spectromètre Bruker 600.
Les déplacements chimiques enregistrés pour la molécule E sont fournis en annexe.
Les déplacements chimiques 1H et 13C enregistrés sont très proches des données obtenues pour les quercotriterpénosides I et II. Les différents signaux caractéristiques de l’arjungénine sont ainsi observés :
- 6 méthyles angulaires sont caractérisés par des singulets situés à δ 0.79 (H26), 0.86 (H24), 0.96 (H30), 0.97 (H29), 1.11 (H25) et 1.34 ppm (H27)
- Une double liaison C=C entre les carbones hybridés sp² à δ 123.4 (C12) et 142.6 ppm (C13)
- Une fonction carboxyle (C28) à δ 177.1 ppm
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 655.34722 C37H51O10 -0.69620 ppm 593.34710 C36H49O7 -0.29767 ppm 169.01259 C7H5O5 -3.32933 ppm 817.40014 C43H61O15 -0.44243 ppm
- 4 signaux correspondant à des protons portés par des carbones hydroxylés à (H2), 5.05 (H3), 3.29 (H19) et 3.01/3.32 ppm (H23, géminés).
- Un proton (H18) à δ 3.07 ppm, caract entre les cycles D et E
Les données ROESY et les constantes de couplage des signaux configurations relatives des jonctions de cycle sont identiques à celles des
Par ailleurs, les signaux correspondant aux groupements galloyle et décrits pour les QTT I et II
confirme les résultats de FT/MS relatifs à la présence de ces groupements sur la génine. La comparaison des spectres
chimiques sont quasi identiques pour les signaux des cycles C, D et E. Il en est de même pour les signaux 13C.
En revanche, plusieurs déplacements chimiques des atomes des cycles A et B sont modifiés. Le proton H3 est encore plus débli
En outre, les protons du méthyle angulaire à
s’agit des H24. Les protons géminés H23 corrèlent avec H2 et H5. La stéréochimie observée pour le carbone stéréogène C4 est donc similaire à celle du
au QTT II. Les protons de l’alcool primaire de la molécule blindés (de 0.6–0.8 ppm) par rapport à ceux du
Figure 55 - Détail du spectre HMBC. Les corrélations présentées permettent de déterminer la position du galloyle (en rouge) et du glucopyranosyle (en vert) sur la génine de la molécule
162
4 signaux correspondant à des protons portés par des carbones hydroxylés à (H2), 5.05 (H3), 3.29 (H19) et 3.01/3.32 ppm (H23, géminés).
δ 3.07 ppm, caractéristique de la configuration cis
Les données ROESY et les constantes de couplage des signaux 1H montrent que les configurations relatives des jonctions de cycle sont identiques à celles des QTT I
Par ailleurs, les signaux correspondant aux groupements galloyle et β-glucopyranos
II (chapitre 6, paragraphes IV.B et V.B), sont observables. Cela confirme les résultats de FT/MS relatifs à la présence de ces groupements sur la génine.
La comparaison des spectres 1H des QTT et de la molécule E montre que les déplacements chimiques sont quasi identiques pour les signaux des cycles C, D et E. Il en est de même pour
En revanche, plusieurs déplacements chimiques des atomes des cycles A et B sont modifiés. Le proton H3 est encore plus déblindé que pour le QTT II (de 4.70 à 5.05 ppm).
En outre, les protons du méthyle angulaire à δ 0.86 ppm corrèlent en ROESY avec H2 s’agit des H24. Les protons géminés H23 corrèlent avec H2 et H5. La stéréochimie observée pour le carbone stéréogène C4 est donc similaire à celle du QTT I mais inversé
. Les protons de l’alcool primaire de la molécule D (H23) sont encore davantage 0.8 ppm) par rapport à ceux du QTT II.
étail du spectre HMBC. Les corrélations présentées permettent de déterminer la ition du galloyle (en rouge) et du glucopyranosyle (en vert) sur la génine de la molécule
4 signaux correspondant à des protons portés par des carbones hydroxylés à δ 3.99
cis de la jonction
H montrent que les QTT I et II.
glucopyranosyle, déjà ), sont observables. Cela confirme les résultats de FT/MS relatifs à la présence de ces groupements sur la génine.
que les déplacements chimiques sont quasi identiques pour les signaux des cycles C, D et E. Il en est de même pour
En revanche, plusieurs déplacements chimiques des atomes des cycles A et B sont modifiés. (de 4.70 à 5.05 ppm).
èlent en ROESY avec H2 : il s’agit des H24. Les protons géminés H23 corrèlent avec H2 et H5. La stéréochimie observée mais inversée par rapport (H23) sont encore davantage
étail du spectre HMBC. Les corrélations présentées permettent de déterminer la ition du galloyle (en rouge) et du glucopyranosyle (en vert) sur la génine de la molécule E.
163
L’étude de la carte HMBC montre une corrélation entre le proton anomère (H1’) et le carbone carboxylique C28 de la génine (figure 55). La position du β-glucopyranosyle sur l’aglycone de la molécule E est donc la même que dans les QTT I et II, ce qui explique les très faibles écarts des déplacements chimiques observés pour les cycles C, D et E.
Par ailleurs, le proton H3 de l’aglycone corrèle avec le carbone C7’’, ce qui montre que l’hydroxyle porté par le carbone C3 est estérifié par le groupement galloyle. Ce groupement est donc situé à la même position que dans le QTT II.
C) Données complémentaires
Pour une concentration de 1 g/L en E, on calcule log(ε) = 2.81 pour un λmax
de 277 nm. Le pouvoir rotatoire mesuré est + 0.011° pour une concentration en E de 0.058 g/100mL. On calcule alors le pouvoir rotatoire spécifique [α]D
= + 20°.
D) Discussion
L’utilisation de la LC-FT/MS a confirmé la pureté et la formule brute du composé E ; il s’agit bien d’un isomère des quercotriterpénosides I et II.
Les expériences RMN réalisées ont permis d’identifier la structure de la molécule E. Il s’agit du 2α,19α,23-trihydroxy-3β-galloylolean-12-ène-28-oate de β-glucopyranosyle (figure 56).
Ce composé est également une nouvelle molécule, jamais identifiée jusqu’à ce jour ; nous le nommerons ainsi quercotriterpénoside III (QTT III).
164
Le QTT III est ainsi un isomère de position du QTT I (le galloyle n’est plus fixé sur le C23 mais sur le C3) et un diastéréoisomère du QTT II (inversion de configuration du carbone stéréogène C4, liée probablement à l’oxydation d’un méthyle différent au cours des mécanismes de biosynthèse).
Ce quercotriterpénoside III est l’isomère de formule brute C43H62O15 le plus abondant dans l’extrait CZNCA analysé en LC-FT/MS.