Figure 3.2 – Fréquence des cancers radio-induits en fonction de la dose et de la
distance du PTV (Diallo et al. 2009).
— Panel A : Fréquence d’incidence des cancers radio-induits selon la distance entre la bordure du volume irradié (PTV) et le site d’origine du second cancer — Panel B : Fréquence d’incidence des cancers radio-induits selon la dose reçue
au site d’origine du second cancer (de 0 à 75 Gy)
— Panel C : Fréquence d’incidence des cancers radio-induits selon la dose reçue au site d’origine du second cancer (Zoom de 0 à 2.5 Gy)
humains normaux de derme (NHDF) et les kératinocytes humains normaux d’épiderme (NHEK). Les NHEK entrent en senescence après 15-20 doublements de population puis, soit meurent par autophagie, soit pour environ une cellule sur 10 000 développent une PSNE, spontanément et systématiquement quel que soit le donneur de cellules. Les NHDF quant à eux entrent en sénescence après 50-60 doublements de population, puis restent dans cet état stable pendant plu- sieurs mois, voire plusieurs années. Les données les plus récentes obtenues dans ce cadre indiquent que les deux types cellulaires présenteraient à la sénescence un ratio CSB/CDB très différent. Les NHDF accumulent à la sénescence les deux types de cassures, avec des CDB dominants et qui persistent sans être réparés, ce qui pourrait constituer un des mécanismes à la base de l’irréversibilité de l’arrêt du cycle cellulaire associé à la sénescence. Dans les NHEK au contraire, seuls des CSB s’accumulent à la sénescence. Elles persistent sans être réparées suite à un défaut d’expression de la PARP1. Les CDB sont rares dans les kératinocytes et ne s’accumulent pas à la sénescence, ce qui pourrait expliquer que certains kératinocytes sénescents soient capables de réentrer dans le cycle cellulaire et générer des cellules PSNE dans lesquelles des mutations auraient pu s’accumuler. Ils ont également montré que seuls les CSB proviennent d’une attaque oxydante. En effet, des traitements antioxydants font diminuer le taux de CSB sans affecter celui des CDB. L’origine de ces dernières nous est pour l’instant inconnue. De façon intéressante, les traitements antioxydants ont aussi pour effet de repousser la sénescence et inhiber la PSNE, ce qui suggère que les CSB, mais pas les CDB, pourraient jouer un rôle moteur dans la PSNE (Nassour et al. 2016).
Le projet sur lequel j’ai travaillé pendant ma thèse a pour objectif d’étudier les mécanismes à l’origine des sarcomes secondaires. L’hypothèse sur laquelle se base le travail est que des fibroblastes normaux de peau en bordure du champ d’irradiation pourraient subir des modifications qui les mettraient à risque pour la transformation. Le long délai observé avant l’apparition de ces sarcomes suggère que ces modifications mettraient les fibroblastes normaux dans un état de dormance, et nous proposons que cet état de dormance soit similaire à de la sénescence. Cet état de dormance/sénescence pourrait être plus proche de l’état de sénescence normale des NHEK que de celui des NHDF, ouvrant ainsi la possibilité qu’il soit suivi d’une émergence néoplasique similaire à la PSNE
3.3. hypoyhèse sur les cancers radio-induits 77
que nous décrivons in vitro. Autrement dit, en termes de dommages à l’ADN, les fibroblastes de la bordure de champ pourraient subir suite au traitement radiothérapeutique un ratio CDB/CSB très différent de celui observé en plein champ.
Les principaux objectifs de mon projet de thèse dans cette partie biologie était donc
1- D’analyser les cassures simple-brin et cassures double-brin subies par des NHDF quand ils sont irradiés en plein champ ou en bordure de champ.
2- D’analyser si les cassures subies sont réparées ou persistantes et d’en analyser les conséquences sur le devenir cellulaire en terme de progression dans le cycle cellulaire et entrée en sénescence.
Chapitre
4
Mise au point du système
expérimental d’irradiation de
fibroblastes en bordure de champ et
techniques de biologie utilisées
Afin de répondre aux questions posées sur la nature et la quantité de dom- mages à l’ADN induits en bordure du champ et en plein champ, ainsi que sur le devenir cellulaire, il a fallu choisir les méthodes expérimentales les plus appropriées.
La première étape a consisté en l’élaboration d’un système expérimental permettant d’irradier des cellules en plein champ et en bordure du champ dans des conditions les plus proches possibles des conditions thérapeutiques.
Dans une deuxième étape nous avons choisi les différentes techniques à utiliser pour répondre au mieux aux questions posées :
1- Le premier objectif était d’évaluer la quantité de CSB et CDB induites par l’irradiation. Pour ce faire nous avons choisi deux techniques expérimentales différentes, à savoir l’ immunofluorescence et les essais comètes. L’immuno- fluorescence nous permet de détecter les protéines nucléaires impliquées dans la signalisation des cassures de l’ADN, et les essais comètes nous permettent de détecter la quantité physique des cassures. Nous pouvons ainsi confronter
deux techniques d’évaluation des cassures, avec une technique indirecte et une technique directe.
2- Le deuxième objectif était de suivre le devenir des cellules irradiées en terme de croissance, d’arrêt dans le cycle, d’induction de sénescence.
— Pour évaluer la croissance cellulaire, la méthode a consisté à compter les cellules régulièrement pendant le traitement et de réaliser une courbe de croissance.
— Pour suivre la position des cellules dans leur cycle, nous avons utilisé une méthode de marquage par l’iodure de propidium suivi de cytométrie en flux. l’IP est un intercalant de l’ADN qui permet de quantifier la quantité d’ADN dans le noyau et ainsi la position dans le cycle. La cytométrie permet d’échantillonner un très grand nombre de cellules (minimum 10 000). On peut ainsi connaître le pourcentage de cellules de notre échantillon qui se trouvent en phase G1, S et G2/M.
— Pour suivre l’induction de la sénescence, nous avons également fait le choix de procéder par cytométrie en flux. De cette façon nous avons eu la possibilité de suivre trois marqueurs qui sont la taille, la granula- rité et l’activité de l’enzyme SA-Beta-Galactosidase en utilisant le sub- strat fluorigène 5-dodecanoylaminofluorescein di-beta-D-galactosidase (C12FDG)(Debacq-Chainiaux et al. 2009). Même si bien d’autres facteurs sont augmentés lors de la sénescence, nous avons ici avec ces trois facteurs qui augmentent à la sénescence la possibilité d’estimer l’établissement de celle-ci.
4.1
Culture de fibroblastes humains normaux
Les cellules qui ont été choisies pour les irradiations sont des NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) parce que ce sont des cellules extraites d’un tissu conjonctif susceptible de développer un sarcome secondaire après radiothérapie. Les cellules poussent en adhérant au fond de boites de culture en plastique. Elles sont cultivées comme indiqué dans l’encart 4.1. Pour les irradiations plein champ et bordure de champ, les boites de culture cellulaire utilisées ont été, en fonction de l’expérience à réaliser, des plaques 96 puits ou des plaques 6 puits.
4.2. Analyse des foyers XRCC1 et 53BP1 81