Partie I Introduction 1
I.3 Principes physiques et méthodes expérimentales
I.3.2 La technique de FRAP
I.3.2.3 Hypothèses et exploitation théorique
II
III
I II III
F(t)
Fraction mobile F(t<0) F(0)FIG. I.3.12: Schéma de principe de la FRAP. Dans la phase I, avant le photoblanchiment, la puissance d’excitation est faible et les marqueurs restent intacts. Dans la phase II, la puissance d’excitation est forte et conduit au pho-toblanchiment des marqueurs. Enfin, dans la phase III, la puissance revient à une valeur faible et la fluorescence mesurée remonte au fil du remplissage de la région photoblanchie par des marqueurs intacts.)
Le rapport entre ce temps et le temps caractérique du mouvement (diffusion ou convection) dépend de la géométrie du système et du faisceau, de la profondeur de photoblanchiment et du type de transport (voir plus loin) [Axelrod et al., 1976].
I.3.2.3 Hypothèses et exploitation théorique
Nous allons exposer ici le modèle d’Axelrod et coll. pour l’analyse des expériences de FRAP à deux dimensions en excitation à un photon. Cette théorie concerne les cas de faisceaux gaussien et homogène circulaire, pour un mouvement diffusif, convectif et pour la combinai-son des deux. Cela nous donnera une base théorique que nous pourrons adapter à notre cas, et nous montrera les courbes caractéristiques que l’on peut obtenir par cette technique.
Le point de départ de la modélisation est de définir la configuration initiale du système juste après la phase de photoblanchiment. Nous nous plaçons dans le cas d’un système plan avec une distribution uniforme de molécules fluorescentes. Pour déterminer la configuration initiale, on considère que le photoblanchiment suit une loi du premier ordre comme nous l’avons vu au début de ce chapitre. Ceci nous donne l’équation suivante pour la concentration :
où est l’intensité d’excitation de photoblanchiment (centrée en . Si la durée de cette phase est faible devant le temps caratéristique du mouvement des fluorophores, ceux-ci peuvent être considérés comme immobiles, et la concentration à la fin de la phase de photo-blanchiment de fluorescence ( ) peut s’écrire :
¡ ¢ £ ¤¥ ¦
§
avec
la concentration initiale avant le photoblanchiment. Cette équation donne du même coup la concentration initiale de la phase de remontée. On définit la «dose» de
photoblanchi-ment par : ¨
¦
©
L’évolution du système pendant la phase de remontée de fluorescence, en l’absence de pho-toblanchiment à ª « ¬ , et en supposant que les molécules diffusent et ont un mouvement de convection selon l’axe ¢
avec la vitesse
, est décrite par l’équation aux dérivées partielles
suivante : ® ¯ ° ± ² ¥ ® ³ ©
On peut choisir comme condition aux limites
´
. La fluorescence observée s’écrit :
µ ¶
·¸ ¹ º »
¼ ²
où¸ est le produit de toutes les efficacités d’absorption, d’émission et de détection, etº est le facteur d’atténuation de l’intensité du laser (º ª ½ ¾ ¿À ¹ ª « ¬ ).
Cas diffusif
Pour un faisceau gaussien (cas le plus fréquemment rencontré en pratique), en écrivant l’intensité ·Á ª ½ ¾ ¿ À ¹  à ² ¡ ¢ £ ¥ Á ² ¹ à ² avecà la demi-largeur àÄ ¹ ¡ ² , on obtient l’ex-pression suivante pour le cas purement diffusif (
) : µ ¶ ¸ ª ½ ¾ ¿À ºÆÅ ¨ Ç È É Å ª Á ¨ Á Å où Å Ä ¹ Ä Ê Á ¹ Ë Ì ,Ë Ì Ã ² ¹ Í ° , É Å
est la fonction Gamma etª Á
¨
¹ Á
Å
, la distribution de probabilité duÎ ² . La figure I.3.13 (a) montre les courbes obtenues en faisant varier le paramètre
¨
dans la formule précédente.
La figure I.3.13 (b) représente ces mêmes courbes normalisées de la façon suivante :
Ï ¶ ¤µ ¶ ¥ µ ¶ §¹ ¤µ ¶ ´ ¥ µ ¶ §©
On voit sur cette figure que la relation entre Ð Ñ
² etË Ì dépend de la valeur de ¨ . Cette dépendance en ¨
est donc importante et il faut bien en tenir compte dans l’analyse des données. On peut mieux comprendre cette influence en visualisant la configuration initiale du système en fonction de ce paramètre, comme on le voit sur la figure I.3.14.
I.3.2. LA TECHNIQUE DE FRAP 47
(b) (a)
FIG. I.3.13: Courbes théoriques de remontée de fluorescencepour un ensemble de molécules diffusant librement,
avec un faisceau gaussien.(a) : courbes obtenues directement par le calcul; (b) : courbes normalisées entre 0 et 1. (D’après [Axelrod et al., 1976]).
FIG. I.3.14: Concentration initiale pour différentes valeurs de Ò , avec un faisceau gaussien. (D’après [Axelrod et al., 1976]).
Cas convectif
Dans le cas purement convectif (ÓÔ Õ ), la formule obtenue pour la fluorescence est :
Ö × ØÙ Ú ÔÛ Ü ÝÞßåçæà áâ ã ä è é ê ë ä Ø ì í Ú ê Øî ï ð Ú ñ ò ó ô õ ì÷ö î î ï ð Ø Ù ø ù Ú ú û ü
Cette fonction est représentée sur la figure I.3.15 pour différentes valeurs deí
. Cas diffusif et convectif
Si les deux types de mouvement sont présents (Ó ý þ ä ÿ Ô Õ ), on a la relation suivante : Ö × Ø Ù Ú ÔÛ Ü Ý Þßåçæà áâ ã ä è é ê ë ä Øì í Ú ê ò ó ô ì ú ê æ ê æ Ø Ú ú î ñ ð ï î Øð ïú Ú ü
FIG. I.3.15: Courbes théoriques de remontée de fluorescence pour un mouvement purement convectif, avec un
faisceau gaussien.(D’après [Axelrod et al., 1976]).
La figure I.3.16 montre la représentation graphique de cette fonction pour et le rapport
= 10, 1 et 0,1.
FIG. I.3.16: Courbes théoriques de remontée de fluorescence pour un mouvement diffusif et convectif, avec un
faisceau gaussien.(D’après [Axelrod et al., 1976]).
Distinction diffusion/convection
On voit bien, d’après ce qui précéde, que l’on peut théoriquement distinguer une remon-tée de fluorescence due à une population de molécules qui diffusent d’une remonremon-tée de flu-orescence due à une population subissant une convection. La courbe typique du premier cas ressemble approximativement à une exponentielle (de la forme
), tandis que dans le second cas on obtient une courbe de type sigmoïde. Le cas «mixte» est plus délicat à analyser et il faut ajuster la courbe théorique aux données pour se prononcer. On peut remarquer que la diffusion est efficace pour remplir le creux en concentration aux temps courts, et de moins en moins efficace au cours de la phase de remontée, tandis que la convection a une efficacité maximale à la moitié de la remontée.
I.3.2. LA TECHNIQUE DE FRAP 49
En pratique, la distinction entre les deux types de mouvements n’est pas toujours possible. Par exemple, si le système expérimental possède une «fréquence de coupure» telle que le point d’inflexion sur les courbes de la figure I.3.15 n’apparaît pas dans les données, on ne pourra pas facilement distinguer les deux cas. L’analyse doit alors se compléter d’une réflexion sur le système étudié avec les informations provenant d’autres expériences pour estimer la nature du mouvement observé.
Une fois le type de mouvement connu, il s’agit d’extraire des données le paramètre fonda-mental de la dynamique du système, c’est-à-dire le coefficient de diffusion et/ou la vitesse du flux ! . Toujours selon la théorie d’Axelrod et coll., il faut d’abord déterminer le" # $ % , puis utiliser les formules suivantes :
&(') % * + " # $ % , - . et ! &(') * " # $ % , - / 0 avec- . &" #$ % * 1 . et- / &" #$ % * 1
/ . Pour un faisceau gaussien, ces coefficients dépendent de2
selon une courbe représentée sur la figure I.3.17.
FIG. I.3.17: Variation du coefficient3 en fonction de4 pour un faisceau gaussien.(D’après [Axelrod et al., 1976]).