Choix du fluorophore

Pour toutes les expériences menées dans cette étude, nous avons utilisé une GFP (Green Fluorescent Protein) comme marqueur fluorescent pour suivre les protéines d’intérêt. En effet, la GFP permet de visualiser un protéine dans des cellules vivantes, de façon «intrinsèque». La GFP appartient à une vaste famille de protéines possédant différentes propriétés photo-physiques variables, et parmi lesquelles nous avons cherché la plus adaptée à notre étude.

II.1.1.1 Les différents mutants de la Green Fluorescent Protein (GFP)

Depuis la découverte de la GFP par Shimomura et coll. en 1962 chez la méduse Aequoera

victoria[Shimomura et al., 1962] et surtout depuis le décryptage de sa séquence d’acides aminés et de sa structure tridimensionnelle, les biologistes se sont beaucoup servis de cet outil comme marqueur fluorescent dans les cellules vivantes. En effet, on peut faire pénétrer dans les cellules l’ADN codant pour la protéine d’intérêt fusionné à l’ADN codant pour la GFP choisie. Les cellules ayant incorporé correctement l’ADN étranger synthétisent ensuite cette protéine liée à la GFP. Cette possibilité de disposer de cellules vivantes marquées multipliables à volonté a

ouvert un vaste champ d’étude, notamment sur les phénomènes dynamiques cellulaires. De plus, de nombreuses équipes ont produit des mutants de la GFP sauvage (wild-type) afin d’en modifier les propriétés photophysiques comme le spectre d’excitation et d’émission, ou encore l’efficacité quantique de fluorescence. Les possibilités de marquage se sont donc accrues, autorisant même des marquages multiples au sein de la même cellule.

Ces mutants sont répartis en 7 classes principales suivant la nature chimique du chro-mophore. En effet, ce sont les mutations des acides aminés constituant le chromophore qui modifient les propriétés photophysiques. La GFP la plus couramment utilisée pour marquer des protéines est la EGFP (Enhanced GFP) dont nous allons voir les propriétés ci-dessous.

II.1.1.2 Comparaison entre EGFP et GFPuv

Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à deux mutants de la GFP, la EGFP (muta-tions F64L, S65T) et la GFPuv (F99S, M153T, V163A). La EGFP a un pic d’excitation à un photon situé à 488 nm et un pic d’émission vers 509 nm. La GFPuv, elle, a un pic d’excitation situé à 397 nm (d’où son nom) et un pic d’émission vers 506 nm.

Pour caractériser ces deux protéines, nous avons d’abord mesuré leur spectre d’émission en excitation à deux photons. Le spectre de la EGFP a été fait sur des cellules de culture HeLa transfectées transitoirement avec l’ADN codant pour la protéine. Les cellules sélectionnées pos-sédaient un marquage cytoplasmique diffus. Pour la GFPuv, les mesures ont été faites dans divers échantillons : en solution, exprimée dans des bactéries, dans un lysat de bactéries ou encore dans les cellules HeLa transfectées comme pour la EGFP. La figure II.1.1 montre les spectres d’émission en excitation à un et deux photons pour chaque protéine.

On constate, d’une part, qu’il n’y a pas de différence notable à l’émission entre les deux modes d’excitation, ni entre les deux protéines. Les spectres présentent tous un seul pic à env-iron 509 nm. Nous pourrons donc utiliser les mêmes filtres d’émission pour observer les deux protéines et comparer leur fluorescence. D’autre part, on peut noter que les spectres d’émission à deux photons de la GFPuv faits dans des conditions différentes sont presque superposables ormis la «queue» située dans le rouge des spectres. Ceci indique une certaine robustesse des propriétés spectrales de cette protéines envers les variations de son environnement.

Le spectre d’émission des deux protéines étant assez identiques, nous avons voulu com-parer l’intensité du marquage dans les deux modes d’excitation en utilisant le même filtre d’émission. Nous avons donc observé les cellules HeLa transfectées avec le microscope à deux photons et en épifluorescence classique. Peu de cellules transfectées avec l’ADN de la GFPuv étaient fluorescentes contrairement à celles transfectées avec l’ADN de la EGFP, et même celles qui l’étaient avaient un signal plus faible que celles exprimant la EGFP.

Pour vérifier si cette différence venait du fait que la GFPuv s’exprimait mais n’était pas fluo-rescente (à cause d’un problème de repliement de la protéine, par exemple), nous avons analysé

II.1.1. CHOIX DU FLUOROPHORE 59

FIG. II.1.1: Spectres d’émission en excitation à un et deux photons de la EGFP et de la GFPuv. La longueur d’onde d’excitation à deux photons était de 830 nm. La ligne verticale sur les spectres à deux photons indique la valeur de 510 nm pour la longueur d’onde.

la quantité de protéines produite dans les cellules après séparation des protéines par élec-trophorèse sur gel de polyacrylamide et réplique immunologique, à partir des cellules HeLa transfectées (voir figure II.1.2).

FIG. II.1.2: Réplique immunologique de cellules HeLa transfectées avec l’ADN codant pour la EGFP ou la GFPuv. La première colonne montre des bandes correspondants aux marqueurs de poids moléculaire. La seconde montre le résultat obtenu avec des cellules HeLa non transfectées et sert de témoin. Sur les deux autres colonnes, on observe une bande vers 30 kD qui correspond au poids moléculaire de la GFP.

Il apparait que la quantité de protéines EGFP est beaucoup plus importante que la quantité de GFPuv, ce qui indique que cette dernière est moins exprimée, à promoteur et durée de mat-uration égaux. Ces observations sont cohérentes avec la faible fluorescence mesurée dans les cellules GFPuv et nous ont conduit à choisir la EGFP comme marqueur des protéines étudiées.