Avantages et applications

 ,  " !  - " # & $  ' () .  / & !

pour une ouverture numérique (0 12 1

 ' ()  ) comprise entre 0,9 et 1,2.

Pour un objectif à immersion à eau, d’ouverture numérique 1,2 et $ = 780 nm, on a les valeurs théoriques suivantes :   " ! 3 4 - 5 6

, ,  " ! 7 " " 5 6 et8 . 9 : ; <; = >  " !  - ? @ (ref laurent). Collecte de la fluorescence

Une fois excités, les fluorophores émettent de la fluorescence d’un seul «point» à la fois, qu’il faut collecter pour obtenir une image de l’échantillon. Pour cela, on utilise le plus souvent le même objectif pour focaliser le faisceau laser dans l’échantillon et collecter la fluorescence. La collecte est donc restreinte à la portion de fluorescence émise suivant un angle solide de

&



& A B C

 D0 12 1/  E , en supposant que l’émission est isotrope. La fluorescence est ensuite séparée de la lumière laser par des filtres chromatiques, puis son intensité est mesurée à l’aide d’un détecteur, par exemple, un photomultiplicateur.

Pour une concentration de fluorophoresF D G H !

+

E , la fluorescence collectée peut s’écrire :

I J KL ; M D + E   & N O .  . P Q F D G H ! + E I . R S T M D G H ! + E U 8 !

oùN est l’efficacité de collection du système expérimental (et ne désigne pas un flux ici), O

.

, l’efficacité quantique de fluorescence à deux photons et

.

, la section efficace d’absorption à deux photons.

La fluorescence mesurée est donc proportionnelle à la concentration des molécules fluores-centes dans l’échantillon et peut refléter les éventuelles variations de concentration, toujours dans la limite où aucune saturation de l’excitation n’a lieu.

I.3.1.3 Avantages et applications

L’intérêt majeur de la microscopie à deux photons est la possibilité de faire des «coupes optiques» d’un échantillon en n’excitant seulement le plan focal, et non sur toute l’épaisseur comme en microscopie «classique». On peut ensuite obtenir une reconstruction tridimension-nelle de l’échantillon avec un logiciel de traitement d’image. La microscopie confocale permet également de faire des coupes optiques, et nous allons comparer ces deux techniques.

I.3.1. LA MICROSCOPIE À DEUX PHOTONS 41

Comparaison avec la microscopie confocale

Le principe de fonctionnement d’un microscope confocal est basé sur le filtrage spatial de la lumière provenant de l’échantillon. Concrètement, on place un petit trou (pinhole) conjugué avec le foyer de l’objectif devant le détecteur de fluorescence. Dans ce cas, seule la lumière provenant directement du foyer pourra atteindre le détecteur, les autres photons étant perdus. Ce principe est illustré sur la figure I.3.10. En microscopie à deux photons, ce filtrage est inutile car on sait que toute la fluorescence détectée provient du volume d’excitation, en particulier même les photons ayant subi de la diffusion dans un échantillon épais peuvent être détectés. Il est également inutile de «déscanner» la fluorescence et on peut placer les détecteurs le plus près possible de l’échantillon. Ces deux avantages augmentent l’efficacité de collection de la fluorescence et permettent de faire des images plus profondément dans les échantillons diffu-sants (par exemple, un tissu biologique). La profondeur atteignable est encore augmentée grâce à la longueur d’onde de la lumière d’excitation utilisée en excitation à deux photons, le proche infrarouge, plus pénétrante que la lumière visible.

FIG. I.3.10: Comparaison du principe instrumental de la microscopie confocale (gauche) et de la microscopie à

deux photons (droite)[Fricke, 2000].

L’écart entre la longueur d’onde de la lumière absorbée et celle de la lumière émise apporte un autre avantage à la microscopie à deux photons. En effet, dans ce cas, les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont très différentes ce qui permet facilement d’éliminer toute lu-mière parasite provenant du laser. A l’inverse, cet écart (appelé décalage de Stokes4) est faible en excitation à un photon et il n’est pas toujours facile en microscopie confocale d’allier

tion chromatique de la fluorescence et efficacité de collection.

Un autre avantage décisif de la microscopie à deux photons découle directement de la lo-calisation de l’excitation. En effet, comme nous le verrons au sujet de la FRAP, lorsqu’on excite un fluorophore, il y a une certaine probabilité qu’il soit photoblanchi. Dans le cas de la mi-croscopie confocale, l’excitation n’étant pas localisée, tout le cône de lumière émergeant de l’objectif excite les fluorophores et induit potentiellement du photoblanchiment dans ce même cône, notamment lors de l’acquisition d’une série d’images dans le même plan ou dans des plans proches 5. En microscopie à deux photons, l’excitation n’a lieu qu’a l’endroit observé et, par conséquent, il n’y a pas de photoblanchiment dans le reste de l’échantillon. Une con-séquence capitale est la réduction de la phototoxicité, rendant possible l’observation prolongée d’échantillons fragiles comme des embryons.

La figure I.3.11 montre l’effet du photoblanchiment pour les deux types de microscope. Seule la région délimitée par le rectangle blanc est réellement observée, et toute la fluorescence générée hors de ce plan est perdue avec autant de phototoxicité inutile.

FIG. I.3.11: Comparaison du photoblanchiment en microscopie confocale (gauche) et en microscopie à deux

pho-tons (droite)[Piston et al., 1994].

Utilisation en biologie

Les applications de la microscopie à deux photons en biologie sont très nombreuses et var-iées. On peut généralement les classer en deux catégories : les utilisations pour l’imagerie et les utilisations pour des mesures ou des actions locales : mesure de concentration, de durée de vie, de spectre d’émission, FCS ou encore photoactivation de fluorophores.

En imagerie, on peut utiliser cette technique de la même façon que la microscopie confocale, pour faire des coupes optiques d’échantillons fixés (au sens biologique du terme, c’est-à-dire morts) afin d’étudier la distribution de tel ou tel marqueur ou protéine dans une cellule ou un tissu. Dans ce dernier type d’échantillon, nous avons vu l’avantage du microscope à deux pho-tons pour l’imagerie en profondeur. La microscopie à deux phopho-tons permet également de faire des images pendant de longues durées de certains échantillons sensibles à l’excitation comme