Effet d’un inhibiteur de l’activité ATPase sur le mouvement de BBMI-GFP116

Pour caractériser plus précisement la composante du mouvement de BBMI-GFP due à son activité ATPase, nous avons traité les cellules avec du BDM (2,3-ButaneDiol Monoxyme) en solution à 20 mM dans le milieu de culture. Les cellules ont été incubées 10 minutes avant les expériences, puis observées pendant 20 minutes. Le BDM est un inhibiteur de l’activité ATPase des myosines et l’on s’attend, si le mouvement est «actif», à voir un effet sur la courbe de remontée, soit un changement de la forme de la courbe dû à la perte de la composante active, soit une diminution globale du mouvement.

La courbe après traitement a une forme très semblable à celle obtenue avant traitement, mais décalée vers les faibles valeurs d’intensité de fluorescence (voir figure III.2.4).

La fraction mobile après traitement est de 45 6 %, très similaire à celle avant traitement. La profondeur de photoblanchiment est de 83 0,4 % et le  est d’environ 0,6 s. L’augmentation de la profondeur de photoblanchiment après traitement indique que la mobilité est réduite après traitement2. L’ajustement de la courbe après traitement au BDM indique, en effet, une

2La profondeur de photoblanchiment dépend essentiellement du temps caractéristique de photoblanchiment du fluorophore, de la durée de la phase de photoblanchiment, de la fraction mobile et de la dynamique de la molécule étudiée. Ici, seuls les deux derniers paramètres varient, mais l’effet de la fraction mobile est faible. On considère donc qu’une différence de profondeur est surtout la signature d’une différence de mobilité (voir le premier chapitre de cette partie).

III.2.1. BBMI-GFP A UNE ACTIVITÉ MOTRICE DANS LA BORDURE EN BROSSE 117

A. B.

FIG. III.2.4: Effet du BDM sur le mouvement de BBMI-GFP dans les microvillosités. A : courbe de remontée de fluorescence de BBMI-GFP avant ( ) et après traitement (o, 112 acquisitions), B : ajustement théorique en représen-tation différentielle avec     m .s  et une fraction mobile de 85 % pour la courbe après traitement.

mobilité significativement réduite (D = 0,8 contre 1,2) et une fraction mobile légèrement plus faible (85 % contre 90 %). Les deux courbes sont bien ajustées par un modèle diffusif simple.

Il y a donc un effet du BDM sur le mouvement de BBMI-GFP, dans le sens d’un ralentisse-ment. Le BDM agissant spécifiquement sur les myosines et non sur de nombreux processus cellulaires comme dans le cas de la diminution de la quantité d’ATP, ces résultats confirment donc le fait qu’une partie du mouvement de BBMI-GFP est dû à son activité ATPase.

III.2.1.3 Rôle du domaine moteur dans le mouvement de BBMI-GFP

Pour écarter un éventuel effet indirect de l’inhibition de l’activité des autres myosines de la bordure en brosse sur le mouvement de BBMI-GFP lors du traitement au BDM, nous avons comparé le mouvement de celle-ci avec celui de BBMI 730-GFP. En effet, comme nous l’avons vu dans la partie II, la protéine BBMI 730 correspond au domaine carboxy-terminal de BBMI. Elle est dépourvue de domaine moteur, et donc des sites de liaison à l’actine et d’hydrolyse de l’ATP. Elle est localisée dans la bordure en brosse, comme BBMI, semble plutôt associée à la membrane plasmique d’après des expériences de fractionnement où elle est retrouvée avec la partie soluble par le Triton X100 (un détergent qui solubilise la membrane plasmique), alors que BBMI est retrouvée avec l’actine dans la partie non soluble (voir figure III.2.5). Son mouvement devrait donc correspondre à la composante du mouvement de BBMI indépendant de l’ATP.

La figure III.2.6 représente les courbes de remontée de fluorescence pour les deux protéines, dans les microvillosités.

La fraction mobile et la profondeur de photoblanchiment de BBMI 730-GFP sont plus faibles que celles de BBMI-GFP, indiquant une mobilité plus faible. Le décalage entre les deux courbes est similaire à celui observé lors du traitement par le BDM. L’ajustement théorique

FIG. III.2.5: Réplique immunologique de fractions de bordures en brosse de cellules Caco-2 exprimant soit

BBMI-GFP, soit BBMI 730-GFP.La première colonne montre la présence des deux protéines dans la bordure en brosse (BB). Les colonnes PTx et STx montrent respectivement la présence des protéines dans la partie insoluble (P) ou soluble (S) au Triton X100. Les colonnes PATP et SATP correspondent à ces mêmes fractions après ajout d’ATP et indique que BBMI-GFP interagit de façon ATP-dépendante avec la partie insoluble qui contient les filaments d’actine.

A. B.

FIG. III.2.6: Comparaison entre le mouvement de BBMI-GFP et BBMI 730-GFP.A : : courbe de remontée de fluorescence de BBMI-GFP, o : courbe de remontée de fluorescence de BBMI 730-GFP (207 acquisitions), B : ajuste-ment théorique en représentation différentielle avec      m.s  et une fraction mobile de 85 % pour la courbe de BBMI 730-GFP.

confirme cette observation : la mobilité est réduite par rapport à celle de BBMI (D=0,8) et la fraction mobile également (85 %), comme pour la courbe de remontée de BBMI après traite-ment au BDM (voir figure III.2.6).

Si nous comparons maintenant directement les courbes de BBMI-GFP après traitement au BDM et celle de BBMI 730-GFP, on voit qu’elles se superposent très bien (voir figure III.2.7), ce qui prouve que le traitement par le BDM a un effet bien spécifique sur le mouvement de BBMI-GFP.

Nous voyons donc que, lorsque l’on inhibe l’activité ATPase de BBMI par le BDM, le mou-vement de BBMI-GFP est identique à celui du domaine carboxy-terminal de la protéine, ce qui indique que la différence entre les courbes de BBMI-GFP avant et après traitement est bien due à l’activité motrice de BBMI-GFP.