méthodologies retenues
Hypothèses
La première hypothèse de mes travaux de recherche est que l’enzyme du métabolisme UGT2B28, pourrait avoir une expression différente dans le tissu prostatique tumoral en comparaison à son expression dans le tissu sain, et pourrait exercer un rôle dans la progression du cancer de la prostate.
Ma seconde hypothèse est que cette enzyme, par le contrôle qu’elle exerce sur la biodisponibilité des hormones stéroïdiennes, pourrait moduler les niveaux hormonaux en circulation dans un contexte tumoral.
Objectifs et méthodologies retenues
Objectif général : Étude de l’expression de l’enzyme UGT2B28 dans le cancer
de la prostate (CaP) et son lien avec le profil hormonal en circulation.
L’objectif était d’étudier l’expression de la protéine UGT2B28 dans du tissu prostatique sain et tumoral humain. Nous avons ensuite étudié la relation entre son expression protéique et les caractéristiques clinico-pathologiques, ainsi qu’avec les niveaux circulants d’hormones sexuelles stéroïdiennes de patients atteints du cancer de la prostate. Dans cette optique, différentes méthodologies ont été utilisées incluant l’immunohistochimie par matrice tissulaire, la quantification d’hormones sexuelles stéroïdiennes sériques par spectrométrie de masse, ainsi que des analyses statistiques.
Objectif 1.1. Étude de la localisation cellulaire et subcellulaire d’une enzyme
du métabolisme des hormones stéroïdiennes, UGT2B28, dans du tissu
prostatique sain et tumoral.
Dans la littérature, les études portant sur UGT2B28 sont peu nombreuses, et aucune ne porte précisément sur la protéine. Ainsi, le projet auquel j’ai participé dans le cadre du doctorat, étant basé sur l’étude de la protéine, le laboratoire a développé un anticorps
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spécifique. Du fait de la forte homologie des UGT2B, et spécifiquement entre UGT2B28 et UGT211, identiques à 96%, un peptide unique a été créé (Levesque, Turgeon et al. 2001). La spécificité de l’anticorps a été validée par western blot, comme démontré dans le chapitre I. Dans le tissu prostatique sain et tumoral, la localisation cellulaire et subcellulaire de la protéine UGT2B28 n’avait jamais été déterminée. Dans cette optique, la méthode que nous avons utilisée est l’immunohistochimie, technique communément utilisée pour l’étude d’expression protéique sur coupe tissulaire (Maity, Sheff et al. 2013). L’application des normes de standardisation, notamment l’utilisation de contrôles négatifs biologiques et techniques, renforce la probité de nos résultats (Torlakovic, Francis et al. 2014). En effet, la présence de tissus de patients ayant une deletion pour le gène UGT2B28 constituait un contrôle négatif convaincant. Une analyse de tissus prostatiques sains (n=4) et de tissus prostatiques de patients atteints du cancer de la prostate (n=5), a été effectuée. Les tissus sains provenaient de dons d’organes et les tissus prostatiques tumoraux de prostatectomie de patients suivis et traités à l’hôpital Hôtel Dieu de Québec.
Le personnel de recherche du groupe d’uro-oncologie de l’HDQ a réalisé les immunohistochimies et l’analyse de l’expression d’UGT2B28. Les résultats de cette analyse qui sont présentés dans l’article, ont permis de déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire de la protéine UGT2B28, et ont démontré une expression différentielle entre le tissu sain et le tissu tumoral.
Objectif 1.2. Association de l’expression de la protéine UGT2B28, avec les
caractéristiques clinico-pathologiques de patients atteints du cancer de la
prostate.
Nous souhaitions déterminer si UGT2B28 avait une expression différentielle en fonction des paramètres cliniques dans une cohorte de 239 patients caucasiens atteints d’un cancer de la prostate. Tous les patients composant cette cohorte étaient atteints d’un cancer de la prostate cliniquement localisé, et avaient été traités par prostatectomie radicale. Les paramètres clinico-pathologiques étudiés étaient : la taille de la tumeur, la taille de la prostate, le score de Gleason, le niveau d’APS au diagnostic, le statut nodal, les marges positives, et les stades pT. Pour l’analyse de l’expression protéique, nous avons utilisé la méthode de l’immunohistochimie avec une matrice tissulaire ou TMA (Tissue microarray) et avons effectué des analyses par le biais de tests statistiques.
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La matrice tissulaire figure en effet parmi les dernières technologies en histologie et est indispensable pour les études à grande échelle. Cette méthode permet en effet d’analyser simultanément plusieurs centaines d’échantillons tissulaires. La préparation des tissus et l’interprétation des marquages ont été effectuées par deux professionnels, Hervé Brisson et Hélène Hovington, ainsi que par le pathologiste Dr. Têtu. En se basant sur ce qui s’établit communément dans la littérature, la graduation de l’intensité de marquage a permis de déterminer les positifs et négatifs. Parmi les positifs, le pourcentage de marquage a été classifié en trois groupes : ≤10, [10-50] et >50 (Zhou, Lawrence et al. 2012, Magnussen, Rikardsen et al. 2014).
Pour les analyses statistiques, nous avons d’abord testé la normalité de notre cohorte avec les tests Kolmogorov-Smirnov, et Shapiro-Wilk. L’association avec les paramètres clinico-pathologiques a ensuite été effectuée avec le test Kruskall-Wallis. Ce test alternatif de l’Anova pour les données dites non normales, s’effectue pour des variables continues, et permet de tester l’hypothèse selon laquelle les échantillons sont issus de la même distribution en se basant sur les rangs. Pour les paramètres dichotomiques, nous avons réalisé le test U de Mann-Whitney, qui est une alternative non paramétrique au T-test. Enfin pour déterminer si l’expression de la protéine UGT2B28 était associée avec la progression tumorale, nous avons effectué une analyse multivariée de Cox. La progression tumorale a été définie de façon similaire aux précédents travaux du laboratoire, soit par les paramètres définissant la progression en clinique : BCR, métastase, mort (Nadeau, Bellemare et al. 2011, Audet-Walsh, Bellemare et al. 2012, Paller and Antonarakis 2013). Nous avons ajusté l’analyse pour les paramètres cliniques confondants, tels que la PSA au diagnostic, le score de Gleason, le pathologique T stage, l’âge au diagnostic, la thérapie néo adjuvante et adjuvante, le statut fumeur, et la présence de marges ou de statut nodal. Le hasard ratio (HR), qui est le rapport de risque instantané, correspondait à la survenue de l’évènement « progression ». Dans notre cas, il représentait le ratio entre les patients positifs pour l’évènement « progression » et les patients négatifs pour l’évènement « progression ». La force du test multivarié réside en la détection de facteurs risques, indépendants pour la variable testée puisqu’on l’ajuste pour les facteurs confondants. J’ai été particulièrement investie dans ces analyses.
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Objectif 1.3. Étude de l’influence d’UGT2B28 sur les niveaux hormonaux
circulants chez les patients atteints du cancer de la prostate.
La spectrométrie de masse a remplacé la méthode radio-immunologique au cours des dix dernières années, pour devenir la référence en ce qui concerne la mesure des hormones stéroïdes en circulation (Soldin and Soldin 2009). Bien que les études comparant les deux méthodes décrivent une forte similitude entre les mesures, elles ont également démontré que la spectrométrie de masse est une méthode plus sensible, plus spécifique et plus précise. Cette technique permet ainsi une grande reproductibilité des mesures à des seuils de détection plus bas (Hsing, Stanczyk et al. 2007, Stanczyk, Lee et al. 2007, Faupel-Badger, Fuhrman et al. 2010, Krone, Hughes et al. 2010). Pour effectuer notre analyse, nous avons utilisé la cohorte précédemment décrite de 239 patients, ainsi qu’une deuxième cohorte de 51 patients double délétants UGT2B28 et atteints d’un cancer localisé, tous traités par prostatectomie. Les patients ayant reçu de l’hormonothérapie ont été exclus. Les échantillons sanguins ont été recueillis afin d’effectuer le dosage des stéroïdes en circulation par des méthodes analytiques de type GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) et HPLC-MS/MS, établies et validées par notre groupe de recherche (Nadeau, Bellemare et al. 2011, Levesque, Huang et al. 2013, Levesque, Laverdiere et al. 2014).
Sachant qu’UGT2B28 a pour substrat la testostérone et les métabolites de la DHT, nous avons mesuré la testostérone, l’ADT-glucuronide, ainsi que les deux glucuronides 3α-diol-3G et le 3α-diol-17G ne connaissant pas la position glucuronidée par UGT2B28. L’enzyme UGT2B28 glucuronidant également les estrogènes, nous avons dosé l’E1-S, l’E1 et l’E2. Aussi, afin d’avoir un aperçu de toute la cascade hormonale, nous avons mesuré les hormones en amont et en aval, soit la DHEA-S, la DHEA, l’androstenediol, l’androstenedione, la dihydrotestostérone et l’ADT.
Afin de faciliter la comparaison entre les groupes d’expression d’UGT2B28 (≤10%, >10–50%, et >50%), nous avons utilisé les valeurs des niveaux hormonaux non transformés. Pour l’analyse statistique, nous avons utilisé un modèle linéaire généralisé (GLM), qui est un modèle de régression multiple linéaire pour une variable dépendante ajustée par des facteurs confondants. Ainsi, les résidus logarithmiques des niveaux hormonaux ont été ajustés par les facteurs associés, que sont le statut fumeur et l’âge.
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