1.1 Contexte et objectifs
Les contaminants environnementaux peuvent affecter le système endocrinien par de nombreux mécanismes, à l’image les dioxines et composés dioxine-like qui sont capables d’interférer avec la signalisation de ER. Comme nous l’avons vu dans l’article n°3, le ligand de AhR BaP était estrogénique dans les MELN mais anti-estrogénique dans les ZELH-zfERs, soulevant la question de l’implication de AhR dans la réponse des ZELH-zfERs, d’autant que les ZELH-zfERs proviennent de cellules de foie de poisson zèbre où les genes ahr2 et cyp1a sont inductibles (Eide et al., 2014).
L’objectif de cette étude est d’évaluer une possible interaction entre ER et AhR dans les modèles utilisés pour évaluer l’estrogénicité environnementale in vitro et in vivo. Pour cela, les bio-essais ont été exposé à la TCDD et à l’E2, seul, en combinaison et en présence d’antagoniste de ER (ICI) ou de AhR (CH223191). L’interaction réciproque entre les deux voies de signalisation a été évaluée en mesurant l’activité de la luciférase (in vitro), EROD (in vitro) et l’intensité de la GFP (test ESAZY), ainsi que l’expression de gènes endogènes ER- (pS2, vtg1-5 et vtg7, cyp19a1b) et AhR-régulés (ahr, ahr2, cyp1a). Ce travail est le fruit d’une collaboration avec Patrice Gonzalez et
Résultats : chapitre C – article n°4
120 son équipe (laboratoire EPOC/OASU, Université de Bordeaux) concernant l’approche moléculaire (PCR) de l’étude.
1.2 Principaux résultats
D’une marnière générale, nous observons qu’il y a une interaction réciproque entre les voies AhR et ER dans tous les modèles étudiés avec des différences marquées entre bio-essais in vitro humain et poisson zèbre et une bonne concordance entre modèles in vitro et in vivo de poisson zèbre.
Sur la voie ER, la TCDD, seule et en présence d’E2, induit une augmentation de l’activité luciférase sur les MELN qui est abolie par l’antagoniste de AhR, le CH223191, confirmant le rôle de AhR. A l’inverse, la TCDD diminue l’activité de la luciférase induite par l’E2 dans les ZELH-zfERs et dans les larves cyp19a1b-GFP. In vitro, l’anti-estrogénicité est beaucoup plus marquée sur l’activité de la luciférase dans les ZELHα que dans les ZELHβ2. A 72h d’exposition, le CH223191 ne permet pas de lever significativement l’effet anti-estrogénique in vitro, mais restaure partiellement l’activité de la GFP dans les larves de poisson zèbre.
Ces interactions croisées sont également retrouvées, dans une certaine mesure, sur l’expression de gènes endogènes cibles de ces récepteurs. Dans les cellules MELN, l’expression de pS2 est différemment affectée par la TCDD : seule, la TCDD diminue l’expression de pS2 et n’a aucun effet en présence d’E2. Dans les ZELHα, seule l’expression induite par l’E2 de la vtg3 est diminuée par la TCDD à 72h d’exposition, et son expression est restaurée en présence de CH223191. Dans les ZELHβ2, seule l’expression induite par l’E2 de la vtg5 est diminuée en présence de TCDD, et son niveau d’expression n’est pas modifié en présence de CH223191. Comparée aux résultats obtenus à 24h d’exposition, l’anti-estrogénicité de la TCDD sur l’expression de vtg5 s’est amplifiée à 72h et n’est plus antagonisée par le CH223191. Dans les larves de poisson zèbre, le profil d’expression de cyp19a1b est totalement similaire au profil d’expression de la GFP, et en présence de CH223191, l’effet anti-estrogénique de la TCDD est totalement levé.
Sur la voie AhR, l’activité EROD est inhibée par l’E2 dans les MELN et l’addition de l’antagoniste de ER, l’ICI, permet de lever cette inhibition et même de potentialiser l’activité EROD. Ce résultat est confirmé au niveau transcriptionnel avec l’expression du cyp1a, montrant
121 l’implication de ER dans la régulation transcriptionnelle du cyp1a. Dans les cellules ZELHα, l’activité EROD est aussi inhibée par l’E2, mais l’addition d’ICI ne permet de restaurer que partiellement l’activité EROD. Contrairement aux cellules MELN, l’expression de cyp1a n’est pas modulée par l’E2 ni par l’ICI dans les ZELH-zfERs. Cependant, une interaction négative entre E2 et TCDD est observée sur l’expression de ahr2 à 72h d’exposition, non modifiée par l’antagoniste de ER, l’ICI. Dans les ZELHβ2, aucune activité EROD n’est détectée, alors que la TCDD induit l’expression du cyp1a. Comme dans les ZELHα, l’expression induite par la TCDD du cyp1a est peu affectée par l’E2, mais une interaction négative est observée au niveau transcriptionnel pour ahr2 à 72h d’exposition. L’addition d’ICI bloque partiellement l’effet de l’E2 sur l’expression de ahr2. De la même manière, l’expression du cyp1a induite par la TCDD n’est pas affectée par l’E2 ou l’ICI dans les larves transgéniques. Cependant, l’E2 et plus fortement la TCDD induisent une diminution de l’expression de ahr2 dans les larves. En co-exposition avec la TCDD, l’E2 diminue l’inhibition de l’expression de ahr2, qui est partiellement restaurée en bloquant ER avec l’ICI.
Dans son ensemble, ces résultats indiquent que l’interaction entre la TCDD et l’E2 est variable en fonction du temps d’exposition et du gène ciblé (luciférase vs gènes endogènes), montrant une dynamique complexe d’interaction entre les deux voies de signalisation dans les bio-essais.
1.3 Conclusion
➢ Il y a une interaction réciproque entre les signalisations de AhR et ER dans tous les bio-essais
➢ La TCDD induit des effets opposés sur la réponse à l’E2 entre bio-essais : inhibition dans les modèles poisson zèbre mais activation sur les MELN
➢ Les effets mesurés in vitro en cellules ZELH-zfERs sont retrouvés in vivo chez l’embryon, attestant de la pertinence des bio-essais in vitro pour révéler des effets chez cette espèce modèle.
Résultats : chapitre C – article n°4
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