Evaluation des xeno-estrogènes en mélange .1 Mélanges de xeno-estrogènes in vitro

équimolaires), ou de leur occurrence environnementale (mélanges représentatifs d’une exposition donnée). On retrouve aussi des plans d’expérience en rayon qui consiste à tester seulement certaines combinaisons de molécules avec un ratio fixe interchangeable (ex: Hinfray et al., 2016).

3.2 Evaluation des xeno-estrogènes en mélange

Les études évaluant des mélanges de molécules estrogéniques in vitro ont généralement testé moins de 10 composés, parmi lesquels les hormones naturelles et de synthèses (E1, E2, EE2), les alkylphenols, le bisphénol A et la génisteine sont les plus souvent retrouvés (Rajapakse et al., 2002; Silva et al., 2011). Les principaux tests utilisés sont le YES (Payne et al., 2000; Rajapakse et al., 2002) et le E-SCREEN (Rajapakse et al., 2004; Scholze et al., 2014), et dans une moindre mesure, les lignées cellulaires humaines avec gène rapporteur (Bermudez et al., 2012; Ghisari and Bonefeld-Jorgensen, 2009). Une seule étude a évalué l’activité d’un mélange spécifiquement sur hERβ (ERβ-CALUX, Seeger et al., 2016). Peu d’informations sont disponibles pour les effets de mélange sur la réponse des ER de poissons in vitro, à l’exception de deux études utilisant des cellules gliales humaines transfectées transitoirement avec les récepteurs de poisson zèbre (zfERα, zfERβ1, zfERβ2) et la luciférase sous le contrôle du promoteur du gène cyp19a1b (Hinfray et al., 2016; Le Page et al., 2006).

Dans la très grande majorité des études, les effets des mélanges de composés estrogéniques sont correctement prédits par le modèle de CA, que ce soit des mélanges équipotents (Frische et al., 2009; Ghisari and Bonefeld-Jorgensen, 2009; Heneweer et al., 2005), équimolaires (Demaegdt et al., 2016; Payne et al., 2000), ou réalisés sur la base de données d’exposition dit « mélanges environnementaux » (Evans et al., 2012). Afin d’évaluer les effets des molécules estrogéniques à faibles concentrations, telles que retrouvées dans l’environnement, Silva et al. 2002 ont reconstitué un mélange équipotent de 8 molécules (comprenant une benzophénone, des PCB, le BPA, la génisteine, et le résorcinol) présentes à des concentrations inférieures à leur NOEC et EC01 (Silva et al., 2002). Alors que chaque composé pris individuellement était inactif, combinés ensemble, le mélange entrainait un effet significatif sur la réponse du test YES.

39 Le concept de « something from nothing » introduit par cette étude, et confirmé par la suite (Rajapakse et al., 2002; Scholze et al., 2014; Seeger et al., 2016), montre que, même à des concentrations très faibles, des molécules ciblant ER peuvent agir conjointement pour éliciter une réponse significative. De plus, les composés estrogéniques en mélanges peuvent influencer significativement la réponse de l’E2, que ce soit des mélanges binaires (Rajapakse et al., 2001) ou de 11 faibles agonistes présents à leurs NOEC (Rajapakse et al., 2002). Les effets aux faibles concentrations et les interactions avec les hormones endogènes montrent que les effets additifs des xéno-estrogènes sont importants à considérer dans l’évaluation du risque, et que l’absence de synergisme n’est pas synonyme d’absence d’effets.

Des déviations par rapport aux prédictions du modèle CA sont parfois reportées, ces effets étant généralement plus faibles qu’attendus et justifiés par l’activation d’enzymes du métabolisme (Silva et al., 2011), par la présence de « modulateurs » ayant une estrogénicité minimale (Evans et al., 2012) ou par l’addition de molécules interférentes (Frische et al., 2009). A ce jour, un seul cas de synergisme majeur a été observé pour des mélanges de 2, 4 et 8 benzophénones testées à leurs NOEC et EC10 sur le test YES (Kunz and Fent, 2006). A l’exception de cette dernière étude, les déviations reportées ne dépassent généralement pas un facteur 5 par rapport à l’effet attendu, indiquant la robustesse du modèle de CA au regard de la variabilité biologique et expérimentale.

3.2.2 Mélanges de xeno-estrogènes in vitro et in vivo chez le poisson

Les études portant sur les effets combinés des xeno-estrogènes chez les poissons ont principalement évalué l’induction de la vitellogénine (mRNA ou VTG plasmatique) in vitro dans des cultures primaires d’hépatocytes (Petersen et al., 2013; Petersen and Tollefsen, 2011) après 7 ou 14 jours d’exposition de poissons juvéniles (Correia et al., 2007; Kunz and Fent, 2009; Thorpe et al., 2003) ou adultes (Brian et al., 2005; Sun et al., 2009; Zhang et al., 2009). Peu d’études ont évalué l’induction de l’aromatase B in vitro (Hinfray et al., 2016;) ou in vivo dans des lignées de poissons zèbres transgéniques au stade embryo-larvaire (Brion et al., 2012; Hinfray et al., 2016; Petersen et al., 2013). La majorité des mélanges testés ne contenait pas plus de 5 molécules, avec généralement les hormones naturelles et de synthèse (E1, E2, E3, EE2), les alkylphenols (OP, NP) et le BPA présents en mélange équipotents. L’absence d’études évaluant l’additivité pour des

Introduction bibliographique : évaluation des xeno-estrogènes

40 mélanges plus complexes (ex : 14 molécules, Scott et al., 2017; ou 6 molécules, Crago et al., 2015) se justifie par la nécessité d’avoir le profil d’activité de chaque molécule, ce qui exige du temps et des organismes plus le nombre de composés augmente, ce qui pose problème au regard de l’éthique et du bien-être animal.

Lorsque l’additivité a été évaluée avec le modèle CA, une bonne corrélation entre l’effet prédit et l’effet observé est généralement observée, indiquant l’absence d’interactions majeures entre molécules estrogéniques in vivo pour induire la vtg (Zhang et al., 2009,2010, Sun et al., 2009, Brian et al., 2005, Thorpe et al., 2001) ou l’aromatase B (Brion et al., 2012; Petersen et al., 2013). Brian et al. (2005) ont été les premiers à évaluer l’additivité d’un mélange de 5 composés in vivo. Ils ont montré que l’E2, EE2, NP, OP et le BPA en mélange équipotent à leur EC50, et en mélange à de très faibles concentrations (1/5 de l’EC50) avaient un effet additif sur l’induction de la VTG après 14 jours d’exposition de vairons à tête de boules adultes mâles. Une étude ultérieure a montré que ces mêmes 5 composés en mélange pouvaient affecter la fécondité des vairons à têtes de boules, même à des concentrations peu ou pas actives quand administrées isolément, illustrant les conséquences possibles sur la performance de la reproduction de poissons mâles de faibles concentrations de xeno-estrogènes (Brian et al., 2007).

De légères déviations du modèle de CA sont parfois reportées in vivo, soit à fortes (Petersen et al., 2013; Thorpe et al., 2003) ou à faibles concentrations (Kunz and Fent, 2009). Les raisons proposées pour les déviations observées sont une métabolisation (Thorpe et al., 2001) et une cytotoxicité plus importante (Petersen et al., 2013; Thorpe et al., 2003), ainsi qu’un possible antagonisme à faibles concentrations entre 3 filtres UV (Kunz and Fent, 2009).

3.2.3 Conclusion

Les composés estrogéniques en mélanges agissent majoritairement de manière additive sur l’activation des ER in vitro et sur l’induction de la vtg et de l’aromatase B in vivo chez le poisson. A la différence des molécules seules, l’effet d’un mélange dépend non seulement des concentrations de molécules présentes mais aussi du nombre de composés, de leur ratio et de leur puissance (Kortenkamp, 2007). Un même mélange peut induire des réponses différentes en fonction du modèle biologique, car chaque molécule n’y a pas nécessairement le même profil d’activité (ex: Evans et al., 2012; Seeger et al., 2016). Les xeno-estrogènes puissants (ex : E1, EE2)

41 étant généralement moins concentrés que les ligands faibles (ex : alkylphenols) dans l’écosystème aquatiques, la caractérisation des niveaux d’exposition est donc une étape essentielle pour évaluer le danger, et en conséquent le risque associé aux mélanges de xeno-estrogènes.

Introduction bibliographique : bio-surveillance des xeno-estrogènes

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Bio-surveillance des xeno-estrogènes dans

l’environnement

Cette partie présente tout d’abord le cadre législatif de la surveillance des ressources en eau en France avec l’implémentation de la Directive Cadre sur l’Eau (DCE, Directive 2000/60/CE), et ses limites concernant l’évaluation de la contamination chimique des masses d’eau. Puis, les grands principes de la bio-analyse sont présentés et illustrés avec des exemples d’application dans l’évaluation la contamination de l’eau par les xeno-estrogènes.