Greffe des cellules dans les muscles TA de souris Rag/md

Une fois que la fusion a été démontrée in vitro, des tests de greffe in vivo dans la souris Rag/mdx ont suivi. Sommairement, les myoblastes humains normaux ont été cultivés dans le milieu MB-1 afin d’obtenir une confluence de presque 100% pour le jour de la greffe. Les MSCs-L DMD (-/-) et IFH30 _{ont été transduites avec le pseudo-lentivirus trois jours avant la greffe. Durant ces trois}

jours, une évolution dans l’expression de la protéine eGFP a été observée ainsi qu’un changement de morphologie cellulaire.

Il est important de préciser que tous les types cellulaires utilisés dans les greffes ne doivent pas fusionner in vitro avant la greffe. Dans tous les cas, un million de cellules ont été greffées par muscle TA dans le modèle Rag/mdx. Tout d’abord, à titre de contrôle positif, des myoblastes originaires d’une culture primaire ont été greffés et ont fusionnés avec succès avec les fibres musculaires de la souris (figure 25).

Figure 25. Immunohistochimie sur des cryo-sections consécutives de muscles de souris greffés avec des myoblastes humains normaux. A) Expression de la dystrophine humaine dans

le TA de la souris Rag/mdx. B) Expression de la lamine A/C humaine. C) Co-localisation de la dystrophine et de la lamine A/C humaine. Grossissement 100X.

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Par la suite, des MSCs-L DMD (-/-) ont été utilisées comme contrôle négatif puisqu’elles ne possèdent pas le gène corrigé de la dystrophine. Par contre, la correction de ce gène n’est pas nécessaire à la fusion in vivo car c’est l’expression du facteur de transcription MyoD qui permet d’induire la myogenèse, et par conséquent la fusion. La détection de la lamine A/C humaine confirme la présence de cellules humaines fusionnées avec les fibres musculaires de la souris (figure 26).

Figure 26. Immunomarquage de différentes cryo-sections consécutives des muscles greffés avec des MSCs-L DMD (-/-). Absence de l’expression de dystrophine humaine dans le TA de la

souris Rag/mdx. La détection de la lamine A/C humaine confirme la présence de noyaux humains et la fusion des cellules avec les fibres de la souris. Grossissement 200X.

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Finalement, des MSCs-L IFH30 _{ayant le gène de la dystrophine corrigé à l’aide des protéines}

TALENs ont été greffées. Cette correction a permis l’expression d’une protéine qui a été détectée par immunofluorescence. La détection de la lamine A/C humaine confirme la présence de cellules humaines fusionnées avec les fibres de la souris (figure 27).

Figure 27. Immunomarquage de différentes cryo-sections consécutives de muscles greffés avec des MSCs-L IFH30_{. Détection de l’expression de la dystrophine humaine dans le TA de la} souris Rag/mdx. La détection de la lamine A/C humaine confirme la présence de cellules fusionnées avec les fibres de la souris. Grossissement 200X.

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5.5 Discussion

La thérapie cellulaire présente une stratégie intéressante pour le traitement de la DMD. Il a été démontré que la greffe de myoblastes sains permet le rétablissement de l’expression de la dystrophine dans les muscles de patients DMD [68, 69]. L’utilisation des hiPSCs ouvre un nouvel avenir dans le domaine. Actuellement, il est possible de reprogrammer des fibroblastes de patient DMD en cellules hiPSCs et de corriger génétiquement le gène de la dystrophine.

Les avantages majeurs de cette avenue thérapeutique sont multiples : la greffe autologue réduit les risques de réactions immunitaires, la méthode est peu invasive et les fibroblastes de peau représentent une importante source de cellules. Par contre, le défi de cette thérapie est la correction préalable du gène de la dystrophine. Dans le cadre de notre étude, il a été possible d’utiliser des hiPSCs dérivées de fibroblastes d’un patient DMD corrigés génétiquement (clone IFH30_{) ou non (clone DMD (-/-) par les TALENs. Ces hiPSCs ont été différenciées en cellules}

similaires aux mésenchymateuses (MSCs-L).

Ces MSCs-L ont été transduites avec le lentivirus MyoD_eGFP, sous le contrôle du promoteur CAG, ce qui a induit la myogenèse et produit une population de myoblastes modifiés. Cette stratégie thérapeutique de correction et de différenciation a été choisie pour pallier aux inconvénients liés à la livraison du gène le plus gros du génome humain. De plus, le vecteur lentiviral employé pour la différenciation a été choisi en fonction de son excellente capacité à transduire un large inventaire de cellules, en division ou non, et son aptitude d’intégration dans le génome de l’hôte pour permettre l’expression du transgène sur une longue période [45].

Il est important de mentionner que l’expression de MyoD à partir du vecteur a comme effet d’induire la différenciation des MSCs-L en myoblastes, mais aussi d’induire l’expression du MyoD endogène, puisqu’il s’agit d’un gène qui s’autorégule. Une fois que les MSCs-L ont été transduites, la cascade de signalisation myogénique est activée pour engendrer des myoblastes qui fusionneront en myotubes. L’efficacité du lentivirus FUGW codant pour MyoD et eGFP a permis d’induire la fusion in vitro dans tous les types cellulaires de MSCs-L, tel que démontré par la détection de la chaine lourde de la myosine.

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Des expériences réalisées avec les MSCs-L qui n’ont pas été transduites, ou qui l’ont été par un lentivirus exprimant eGFP uniquement, ne fusionnent pas. Ceci suggère que l’expression de MyoD est nécessaire pour engendrer la fusion. Cependant, une expression permanente ou soutenue de MyoD diminue le potentiel de fusion des cellules ou la prolifération de celles-ci dû au fait que ce gène maître de la différenciation cellulaire implique une sénescence cellulaire [4]. Une modulation de l’expression de MyoD grâce à des vecteurs inductibles est une avenue à considérer comparativement à notre approche initiale d’une expression forte par le promoteur CAG. Cette approche permettrait de réguler l’expression du gène pour favoriser la prolifération cellulaire avant d’engendrer une différenciation terminale en myotubes.

La greffe des MSCs-L DMD (-/-) dérivées d’hiPSCs non corrigées et des MSCs-L IFH30 _dérivées

d’hiPSCs corrigées génétiquement a démontré la présence de la lamine A/C humaine, confirmant que les cellules humaines greffées ont fusionné avec les fibres musculaires de la souris hôte. En plus de détecter la lamine A/C humaine avec les MSCs-L IFH30_{, il a été possible de valider}

l’expression de la dystrophine in vivo. Il reste néanmoins à démontrer que l’expression de la protéine, qui est localisée au sarcolemme, permet la formation d’un complexe fonctionnel avec les glycoprotéines associées à la dystrophine.

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