Culture cellulaire Culture des cellules myogéniques

Des myoblastes sains ont été isolés d’une biopsie post-mortem d’un enfant âgé de 13 mois (BB13M). Ils ont été cultivés dans le milieu MB-1 commercial (Hyclone, Mississauga, Canada). Ce milieu spécifique aux cellules humaines a été complémenté de 15% de sérum fœtal bovin (FBS) (Gibco, Burlington, Ontario) et de 10 ug/L de « basic Fibroblast Growth Factor » (bFGF) (Feldan, Québec, Canada). Les cellules ont été maintenues à faible passage et à une confluence approximative de 80%. Des analyses par cytométrie de flux du marqueur CD56+ _{dans cette}

population de cellules myogéniques ont indiqué une présence majoritaire, soit 85% et plus, de myoblastes. Ces cellules ont été utilisées comme contrôle positif in vitro pour valider la détection de la chaine lourde de la myosine après fusion. De plus, elles ont permis de confirmer la présence de la dystrophine humaine ainsi que la lamine A/C humaine, après que les cellules aient fusionné avec les fibres du muscle de la souris Rag/mdx.

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Culture des cellules mésenchymateuses

Les lignées d’hiPSCs dystrophiques (DMD -/-) et le clone corrigé (DMD-IFH30_{) sont une}

gracieuseté du laboratoire du Dr Hotta (CiRA Kyoto University, Japan). Ces cellules proviennent de fibroblastes d’un patient DMD possédant une délétion de 75 484 bp, incluant l’exon 44. Ces cellules ont été reprogrammées par des vecteurs plasmidiques épisomaux sans intégration [66]. Les hiPSCs sélectionnées possédaient un caryotype normal, exprimaient des marqueurs de pluripotence comme Nanog et engendraient la formation de tératomes in vivo. Les hiPSCs IFH30

ont été corrigées par une paire de Platinum-TALEN. L’insertion d’une paire de base ‘‘A’’ dans l’exon 45 a permis de rétablir le cadre de lecture, et cette correction a été validée par séquençage de Sanger de l’ADNc des clones [62].

Dans la présente étude, ces cellules hiPSCs dystrophique et corrigées ont été cultivées dans notre laboratoire dans des plaques de 6 puits (Starstedt, Newton, USA) à l’aide de cellules nourricières (MSTO), en suivant les indications du Dr. Hotta. Les zones de différenciation spontanée de nos colonies ont été minutieusement retirées afin de préserver des colonies au contour lisse et bien défini et ayant un faible ratio cytoplasme/noyau. Lorsque les colonies d’hiPSCs ont été stables et que leur aptitude d’auto-renouvellement a été atteinte, les cellules nourricières ont été retirées avec une solution CTK [1 mg/mL de collagénase IV (Sigma), 2.5% de trypsine (Invitrogen), 0.1 mM CaCl2 (Laboratoire MAT) et 20% knockout sérum replacement (KSR)] et les hiPSCs ont été

cultivées dans le milieu mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada). Une fois la confluence de 80% obtenue, les colonies ont été rincées au DMEM/F12 KnockOut™ (Gibco).

Les colonies ont été incubées pendant 7 minutes dans une solution 1 U/mL de Dispase (Stem Cell Technologies), une protéase capable de faire décoller doucement les cellules souches. Lorsque le contour des colonies commence à décoller, les cellules ont été rincées avec du DMEM/F12 KnockOut™ à deux reprises, et 2 mL de ce milieu ont été ajoutés dans chaque puits pour faciliter leur détachement mécanique à l’aide d’un grattoir à cellule. La suspension a été centrifugée à 1000 rpm pendant 5 min et le culot a été remis en suspension dans 10 mL de MB-1 et transféré dans un flacon de culture cellulaire, à 37o_C.

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Différenciation des hiPSCs en cellules similaires aux cellules mésenchymateuses (MSCs-L) Le protocole de différenciation d’hiPSCs en cellules de type mésenchymateuses a préalablement été mis au point dans notre laboratoire [67]. Les hiPSCs IFH30 _{et hiPSCs DMD (-/-) ont été}

cultivées selon ce protocole. Elles ont été entretenues dans le milieu mTeSR-1 pendant quelques jours pour faciliter leur prolifération et limiter leur différenciation. À confluence, ces hiPSCs ont été rincées avec du DMEM/F12 KnockOut™ et cultivées dans le milieu de culture MB-1. À ce stade, ces cellules de type mésenchymateuse ont été différenciées en myoblastes par infections avec le pseudo-lentivirus FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP.

Différenciation des « myoblastes modifiés »

Lorsqu’une culture primaire de myoblastes atteint la confluence de plus de 90% in vitro et que son milieu de culture est réduit en sérum, les cellules fusionnent ensemble et forment des syncytia multinucléés contractiles appelées myotubes. La détection de la chaine lourde de la myosine (MHC), une protéine spécifique au muscle, confirme la formation de myotubes issus d’une population de myoblastes. Cette expérience a été conduite parallèlement avec les BB13M comme contrôle positif et les MSCs IFH30 _{et DMD (-/-) transduites ou non par le lentivirus. La}

transduction des MSCs-L IFH30 _{et MSCs-L DMD (-/-) par le lentivirus}

FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP a été effectuée à 60% de confluence et selon un multiple d’infection de trois (M.O.I). Toutes les cellules ont été cultivées dans le MB-1 pendant la phase de prolifération et de pré-transduction qui varie entre deux à trois jours. Le changement de milieu pour celui de différenciation, soit le DMEM/2% FBS, a été fait deux à trois jours suivant la transduction. Le milieu de différenciation est changé au deux jours.

Détection de la chaîne lourde de la myosine dans les BB13M, les MSCs-L DMD(-/-) et IFH30

Dans une plaque de 24 puits, une immunocytochimie a été effectuée pour détecter l’expression de la chaîne lourde de la myosine (MCH) dans les cellules transduites et les cellules contrôles. Avant d’être fixées à l’éthanol 95%, elles ont été rincées trois fois avec du tampon phosphate salin 1X (PBS 1X) pour retirer toutes traces de résidus protéiques, et ce, même si le milieu de différenciation était faible en sérum.

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Les cellules ont été fixées avec 500 L de méthanol 95% et la plaque a été incubée sous agitation lente, à température ambiante, pendant 15 minutes. Trois rinçages de 5 min avec 500 L de tampon PBS 1X ont précédé l’étape de blocage avec 200 µL d’une solution PBS 1X supplémentée avec 10% FBS, sous agitation lente. La solution de blocage a été remplacée par 200 L de solution de l’anticorps primaire dirigé contre la MHC pendant 1h. Cet anticorps monoclonal de souris a été dilué 1 :100 dans une solution de PBS 1X supplémentée de 1% sérum FBS. L’incubation avec l’anticorps primaire a été suivie de trois rinçages de 5 min, sous faible agitation, avec une solution de PBS 1X. Par la suite, 200 L de solution du second anticorps, soit un anticorps de chèvre dirigé contre les immunoglobulines G (IgG) de souris et couplé au fluorochrome rouge Alexa Fluor 546®, (Life Technologies) a été ajoutée et incubée pendant 1h. Cet anticorps secondaire a été dilué 1:300 dans du PBS contenant 1 % de FBS. Finalement, après deux lavages avec du PBS 1X, la coloration Hoechst 33258 a été effectuée, laquelle rend les noyaux visibles en bleu. En combinant cette coloration avec l’immunocytochimie, on peut observer la MHC des cellules qui ont fusionné, ainsi que les multiples noyaux alignés.