Construction du vecteur de transfert

Le squelette d’origine du lentivirus, le FUGW, a été offert gracieusement par le Dr David Baltimore (Addgene plasmid #14883) (figure 12) [63]. Ce plasmide est l’élément principal du projet de recherche. Ce vecteur a été modifié pour contenir le gène MyoD humain relié par un peptide 2A à un gène rapporteur, le eGFP. Le tout est flanqué de longues répétitions terminales (LTR) pour faciliter l’intégration dans le génome de l’hôte. De plus, le vecteur contient dans sa séquence originale un promoteur ubiquitine-C humain (hUbC) en amont d’une séquence exprimant la protéine eGFP. Ce promoteur entraîne une expression du transgène caractérisée comme étant modérée.

Figure 12. Cartographie du vecteur FUGW. Le plasmide FUGW contient le promoteur

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Construction du vecteur multicistronique MyoD-P2A-eGFP

Le gène MyoD humain a été amplifié à partir du plasmide fourni par le Dr. Rénald Gilbert, tandis que le gène eGFP a été amplifié à partir du vecteur FUGW. Le protocole d’amplification est celui du kit PCR Protocol for Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Bioloabs, Ipswich, Ma, USA). Les paires d’amorces FORWARD sont construites pour permettre l’amplification des gènes MyoD et eGFP. De plus, ces amorces contiennent des séquences supplémentaires en aval du gène MyoD (séquence REVERSE) et en amont du gène eGFP (séquence FORWARD) pour permettre leur liaison grâce à la formation d’un peptide 2A entre les deux gènes (Tableau 1) [64]. La validation du produit PCR complet a été faite par électrophorèse sur gel d’agarose 0,7%.

Tableau 1. Séquences des amorces utilisées pour la construction des transgènes à introduire dans le vecteur FUGW. En vert sont les sites de restriction, en bleu le codon « start » et en

rouge le codon « stop ».

À l’aide d’une lumière ultraviolette, il a été possible de visualiser sur le gel les fragments PCR amplifiés, de les récupérer avec une lame de scalpel et de procéder à leur extraction. Les gènes MyoD humain et eGFP ont été extraits en suivant le protocole du manufacturier (Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit #K0691). Finalement, le séquençage a validé la nouvelle insertion MyoD_P2A_eGFP (figure 13).

29 Figure 13. Construction du vecteur multicistronique. Schématisation de la stratégie utilisée

pour l’amplification et le clonage des gènes MyoD et GFP liés par un peptide 2A (P2A). Adapté d’Andrea et al. 2014 [64].

Assemblage du vecteur de transfert

Le vecteur FUGW et l’insert ont été digérés par les enzymes de restriction EcoRI et BamHI. Cette linéarisation du plasmide permet l’extraction du gène eGFP. Le vecteur résultant est de 9228 pb. Les extrémités cohésives engendrées par les coupures enzymatiques permettent la ligation du vecteur multicistronique dans le vecteur FUGW linéarisé. Après la ligation exécutée selon le protocole du kit Quick ligation M2200 (New England Bioloabs, Ipswich, Ma, USA), le vecteur recombinant a été transfecté dans les bactéries TOP 10 et étalées sur pétri contenant une concentration d’ampicilline de 50 g/mL. Ces bactéries possèdent une mutation dans le gène recA, diminuant ainsi les mécanismes de recombinaison de l’ADN avec nos constructions génomiques.

Le séquençage a permis de confirmer certains clones. Un clone positif a été cultivé en grande quantité et l’ADN plasmidique a été extrait. À cette étape, le vecteur original FUGW contient l’insertion MyoD_P2A_eGFP sous le contrôle du promoteur ubiquitine-C humain.

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Transfection du vecteur FUGW_hUbC_MyoD_P2A_eGFP

La transfection d’une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein immortalisées (HEK293T) avec le vecteur exprimant les transgènes a été réalisée avec l’agent de transfection lipidique Lipofectamine 2000, selon la procédure du fabricant (Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent, #11668-019), en utilisant un ratio ADN : lipofectamine de 1 : 2. Après 24 heures d’incubation, les cellules ont été lysées sur glace (137 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 et 1% de Triton X-100) et les protéines recueillies par centrifugation et dosées avec la méthode de Bradford. La production des protéines humaines MyoD et eGFP a été confirmée par immunobuvardage.

Détection des protéines par immunobuvardage

20 µg de protéines totales ont été séparées par électrophorèse sur un gel dénaturant de 10% polyacrylamide (SDS-PAGE). La migration a débuté à 70 V pendant 15 minutes et s’est poursuivie pendant 90 min à 100 V dans un tampon de migration composé de Tris 50 mM pH 8.0, 0.2 M Glycine et 0.1 % SDS. Par la suite les protéines ont été électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose 0.2µm (Bio-Rad), à 200 mA, à 4°C, pour 1h (Tris 50 mM pH 6.8, 0.2 M Glycine, 0.1 % SDS et 20 % méthanol). Les membranes ont été incubées dans une solution de blocage contenant 0.1 % PBS 1X, 0.05% Tween™ 20 et 5 % de lait écrémé en poudre pendant une heure à température de la pièce, sous agitation.

Les membranes ont ensuite été incubées pendant 1h à 4°C, sous agitation, avec une solution d’anticorps primaire dilués dans la solution de blocage. Pour la détection de la MyoD humaine, la solution d’anticorps monoclonal de souris a été utilisée à une concentration de 1 : 250. Dans le cas de la détection de eGFP, l’anticorps polyclonal de lapin a été diluée 1 : 2000. Après 1h, les membranes ont été lavées trois fois, pendant 5 min, avec la solution de lavage (0,1 % PBS 1X, 0,05% Tween™ 20). Puis, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires respectifs (anti-souris ou anti-lapin) pendant 1h à température de la pièce. Les anticorps secondaires, couplés à l’enzyme HorseRadish Peroxidase (HRP), ont été dilués 1 : 15 000 dans la solution de blocage. Finalement, trois lavages ont été effectués avant la détection des protéines positives par chemiluminescence (Clarity Western ECL substrate). Les résultats ont été visualisés en exposant un film autoradiographique HyBlot ® CL (Denville Scientific).

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Amplification et substitution du promoteur CAG

Le promoteur hUbC du vecteur FUGW_hUbC_MyoD_P2A_eGFP a été substitué par le ‘‘cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin (CAG)’’. L’avantage de ce promoteur synthétique est qu’il permet une expression plus forte des 2 transgènes liés par le peptide 2A. Le promoteur ubiquitine du vecteur a été éliminé par digestion avec les endonucléases PacI et XbaI. Puis, le promoteur CAG a été amplifié avec une amorce qui introduit les paires de bases complémentaires au vecteur digéré (tableau 2).

Tableau I. Séquence d’oligonucléotide utilisée pour amplifier et cloner le promoteur CAG dans FUGW. Le site de restriction est indiqué en vert.

La ligation du promoteur CAG dans le vecteur a été réalisée à l’aide du kit In-Fusion Cloning technology (Clonetech Laboratories), et la transformation du plasmide a été effectuée dans les bactéries TOP 10. La nouvelle construction FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP a été confirmée par séquençage et par digestion enzymatique visualisée par électrophorèse sur gel d’agarose 0,7%.

5.3.2 Vecteur lentiviral (FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP)

Pour produire un pseudo-lentivirus, il faut co-transfecter quatre vecteurs d’expression. Outre le vecteur de transfert, on retrouve les trois vecteurs plasmidiques servant à produire la transcriptase inverse, les protéines permettant l’encapsidation de l’ADN viral (GAG/POL et REV) et les protéines de l’enveloppe (VSVG). Ces vecteurs ont été introduits par transfection avec la méthode du phosphate de calcium.

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Transfection des vecteurs viraux

Des cellules de la lignée HEK293T ont été cultivées jusqu’à 80 % de confluence dans du High glucose Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM ; Wisent, Saint-Jean-Baptiste, Québec, Canada) contenant de la L-glutamine, glucose, sodium pyruvate, phénol rouge et supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS ; Gibco, Burlington, Ontario), à 37o_{C sous une atmosphère}

de 5% CO2. La transfection au phosphate de calcium se fait en deux temps (figure 14). Pour un

pétri de 10 cm, la solution A contient 15 µg des vecteurs FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP et GAG/POL ainsi que 5 µg des vecteurs REV et VSVG. De plus, 50 µL de chlorure de calcium (2.5 M CaCl2) sont ajoutés et le volume est complété à 500 µL avec de l’eau. Cette solution a été déposée goutte-à-goutte dans 500 µL d’une solution tampon B (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na2HPO4 pH 7.1), pour un volume final de 1 ml, lequel a été incubé 20 min à

température ambiante.

Pour un bon taux de transfection, l’ajustement du pH est critique. Le phosphate de sodium monobasique (Na2HPO4) et le chlorure de sodium (NaCl) provenaient du Laboratoire MAT Inc

(Québec, Canada). Le tampon HEPES 1M (C8H18N2O4S) et le chlorure de calcium (CaCl2)

provenaient de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA). Le mélange a été par la suite réparti uniformément dans le milieu de culture des cellules, pour une durée de 16 h. Puis, le milieu de culture a été changé et les cellules ont poursuivi leur croissance ainsi que la production du lentivirus pendant 48 h.

Purification du lentivirus

Le milieu de culture des cellules transfectées a été récolté et centrifugé à 2000 rpm pendant 10 min pour éliminer les cellules et les résidus récupérés lors du prélèvement. Le surnageant a été ensuite filtré à travers une membrane de 0.22 µm de ‘‘molecular weight cut off (MWCO)’’. Le filtrat a été transféré délicatement sur une solution de sucrose 20%, dans un tube Beckman stérile pour ultracentrifugeuse, et le volume a été ajusté à 36 mL avec du tampon phosphate salin 1X (PBS) provenant de Wisent Inc. L’ultracentrifugation (OPTIMA™ L-80 XP, rotor SW 28) a été effectuée à 4°C, pendant 90 min, à une vitesse de 24 500 rpm. Le surnageant a été éliminé et le culot, qui contient les particules pseudovirales, a été resuspendu dans 100 µL de PBS 1X et entreposé à 4°C pendant 60 min. Finalement, le pseudo-lentivirus a été conservé à -80°C.

33 Figure 14. Transfection par la méthode de phosphate de calcium. Récapitulatif des étapes de

transfection des quatre vecteurs pour la production du lentivirus. Adapté de www.mirusbio.com/transfectopedia/methods

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Titrage du lentivirus par cytométrie en flux

Des cellules HEK293T ont été cultivées dans une plaque de 24 puits, incluant un puits témoin avant la transduction, laquelle a été effectuée 24h après l’ensemencement des cellules, à une confluence d’environ 60 %. À ce moment, les cellules ont été incubées pendant 48h dans 500 µL de milieu de culture. Celui-ci contenait du DMEM, une quantité de particules pseudo-virales diluées en série et une concentration finale de 4 g/mL de Polybrène, lequel sert à augmenter l’efficacité d’absorption des virions lentiviraux [65]. Après 48h, les cellules ont été rincées au PBS 1X et remises en suspension. Elles ont été centrifugées pendant 10 min à 1000 rpm et fixées dans une solution de 3,75 % formaldéhyde/PBS. La quantité de cellules fluorescentes, c’est-à- dire transduites par le pseudo-lentivirus qui exprime la protéine eGFP, a été déterminée par cytométrie en flux. Le titre viral du pseudo-lentivirus FUGW_CAG_MyoD_P2A_eGFP était de 2 x 108 _unités/mL.

5.3.3 Culture cellulaire