polissacarídeo do Anacardium occidentale L. como curativo
Flaviane Maria Florêncio Monteiro1,2, Germana Michelle de Medeiros e Silva1, Tatiana Souza Porto1,3, Camila Souza Porto1, Benício de Barros Neto4, José Luiz de Lima Filho1,5, Ana Maria dos Anjos Carneiro-Leão1,6, Maria das Graças Carneiro-da- Cunha1,5, Ana Lúcia Figueiredo Porto1,6.
1 Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) - UFPE, 2 Programa de Pós-Graduação em
Ciência Veterinária-UFRPE; 3 Programa de pós-graduação em Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica-
USP; 4 Departamento de Química Fundamental – UFPE; 5 Departamento de Bioquímica – UFPE; 6
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal – UFRPE.
Resumo
Um planejamento experimental (22) foi aplicado para determinação das melhores condições de enclausuramento da tripsina em filmes de polissacarídeo A. occidentale L. (POLICAJU). Foram analisados os efeitos das variáveis de controle a concentração de tripsina e temperatura, tendo como variáveis de resposta às atividades volumétrica e específica da enzima. Observou-se que a temperatura de imobilização não influenciou significativamente (p ≤ 0,05) a atividade da enzima, enquanto que a concentração da tripsina foi a variável que mais influenciou nas variáveis de resposta, sendo este efeito negativo. A interação entre as variáveis estudadas não apresentou efeito significativo, e a melhor condição da enzima imobilizada (DEI) foi obtida na concentração de 100µg/mL. Os valores de pH e temperatura ótimos da tripsina imobilizada foram de 9,0 e 55oC, respectivamente. O DEI demonstrou estabilidade na ampla faixa de temperatura testada (25-65oC), enquanto que só nos valores de pH 9,4 e 10,2 apresentou-se estável (cerca de 80% de atividade retida) durante o período de 1 hora. Quanto à estabilidade ao armazenamento em temperatura ambiente (25oC) o DEI reteve cerca de 30% de sua atividade ao final de 28 dias. Os resultados das avaliações histopatológicas da aplicação do DEI em lesões cutâneas demonstraram uma aceleração do processo cicatricial, sugerindo sua possível utilização como curativo dérmico.
Palavras chave: imobilização, filme polimérico, tripsina, planejamento estatístico,
Introdução
No processo cicatricial, a degradação proteolítica da matriz extracelular (MEC) é uma etapa essencial para a reparação e os subseqüentes estágios de remodelação, que ocorrem geralmente através da ação de metaloproteinases de matriz (MMP). Estas enzimas são responsáveis pela degradação controlada de componentes da MEC como colágeno, fibronectina, laminina, proteoglicanos e elastina. Tal degradação controlada é necessária para permitir a remoção de elementos celulares e extracelulares danificados, favorecendo a migração celular, angiogênese, aderência celular e destruição da membrana basal, eventos essenciais para a cicatrização normal (PRAGAPATI et al, 2000). Entretanto, o desequilíbrio da expressão ou da atividade catalítica de MMPs pode contribuir para a destruição da matriz (TRENGOVE et al, 1999, NAGASE et al, 2006).
As proteases, nesse contexto, podem ser compreendidas como princípios ativos, sendo empregadas no tratamento de feridas e queimaduras (THANGAN & RAJKUMAR, 2002), além do debridamento de úlceras (SAID & PIETRO, 2004). Uma outra perspectiva é a imobilização dessas enzimas em suportes poliméricos para aplicação terapêutica em procedimentos clínico-cirúrgicos, envolvendo reparo cicatricial. O procedimento de imobilização por oclusão em géis ou membranas orgânicas corresponde ao confinamento do material biológico em uma matriz polimérica ou em uma membrana semipermeável, podendo o sistema ser revestido por uma membrana polimérica permeável, para reduzir a lixiviação do material biológico. As principais vantagens deste tipo de imobilização estão relacionadas à sua versatilidade, podendo ser aplicada a qualquer tipo de enzima e a não interação enzima- polímero, minimizando os efeitos sobre a estrutura protéica e a desnaturação. A lixiviação do material enzimático tradicionalmente considerada como uma desvantagem dessa metodologia (ALFAYA & KUBOTA, 2002; DALLA-VECCHIA et al, 2004) pode ser encarada na perspectiva de um sistema de liberação controlada do princípio ativo, uma vez que drogas
adsorvidas ou encapsuladas por polímeros apresentam uma difusão lenta e controlada através do material polimérico.
Entre os biopolímeros freqüentemente usados como suportes para enclausuramento (alginato, agarose, quitina e quitosana) os polissacarídeos e seus derivados tem sido usados na área médica para a fabricação de cápsulas biodegradáveis, materiais para sutura, substituição de tecidos e implantes diversos (GERESH et al. 2000; VAN de VELDE & KIEKENS, 2001). Além de apresentarem baixa toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade, podem ser utilizados em processos biotecnológicos, a exemplo dos sistemas de liberação controlada de drogas (KUMAR, 2000; ALSARRA et al, 2004). Um outro aspecto a ser considerado é a estimulação in vitro e in vivo do sistema imune, contribuindo favoravelmente no desenrolar do processo cicatricial, podendo ser utilizados como biomateriais (DIALLO et al., 2001; UENO et al., 2001; KWEON et al., 2003; SENEL & MCCLURE, 2004).
O heteropolissacarídeo extraído da goma do Anacardium occidentale L. (POLICAJU) tem apresentado resultados terapêuticos satisfatórios frente ao processo de cicatrização de lesões cutâneas em camundongos e caprinos (MONTEIRO, 2004; SCHIRATO et al., 2006). Trata-se de um recurso natural e renovável, passível de ser explorado sem impactos ambientais. Assim, a facilidade de acesso a sua matéria-prima e a sua relatada atividade biológica, são fatores que viabilizam o uso do polímero como biomaterial, despertando o interesse científico-tecnológico para o desenvolvimento de fórmulas farmacêuticas para uso em lesões cutâneas.
Uma vez que o método de imobilização pode promover alterações estruturais na enzima e em seu micro-ambiente, características físico-químicas como temperatura e pH ótimos, cinética enzimática, termoestabilidade, resistência à degradação proteolítica e desnaturação também podem ser modificadas (DREVON, 1997; KRAJEWKA 2004). Considerando estes fatores, é preferível que o método empregado para imobilização cause o
mínimo de alteração possível à enzima. Segundo DEY et al. (2003), o método de enclausuramento cumpre este critério, uma vez que ocorre pouca interação entre a enzima e o suporte.
A avaliação de fatores como: pH, temperatura, concentração enzimática, os quais influenciam no processo de imobilização, pode ser realizada através da utilização de planejamento estatístico de experimentos, os quais permitem realizar análises mais refinadas desses fatores por meio de modelagem das variáveis de resposta. Além disso, pode-se empregar planejamentos fatoriais, o que possibilita trabalhar com diversas variáveis, em diversos níveis, sem tornar o experimentos onerosos e reduzindo o tempo de execução dos mesmos (DAL MOLIN et al., 2005).
O presente trabalho teve como objetivo determinar as melhores condições de imobilização da tripsina por enclausuramento em POLICAJU solubilizado em NaCl 0,15M, utilizando um planejamento estatístico para avaliar a influência do pH e da temperatura sobre a atividade da tripsina livre e imobilizada, e aplicar o filme com tripsina imobilizada como curativo em feridas cutâneas, bem como analisar histopatologicamente seus efeitos no processo cicatricial de lesões cutâneas experimentais em camundongos.