Chapitre 4 : Liposomes et protéoliposomes : préparation et applicationsapplications
1.2.2 Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)
De par leur taille (5-200 µm) et composition membranaire, les vésicules géantes unilamellaires ressemblent grandement à des cellules ou à leurs compartiments subcellulaires que l’on peut trouver dans les différents types cellulaires.
Grâce à leurs caractéristiques membranaires mimant celles des cellules, les GUVs sont actuellement intensivement étudiées dans différents domaines de la chimie biomimétique et
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de la biophysique des membranes. La Figure 4.6 est très représentative des possibilités que peuvent offrir les GUVs. Il est ainsi possible d’étudier leur membrane comportant des compositions variables ou asymétriques, d’utiliser des lipides permettant de fonctionnaliser la membrane ou d’insérer des protéines membranaires comme nous le verrons à la section 3. Enfin il est aussi possible d’encapsuler des solutions de compositions variées.
La taille des GUVs fait qu’elles permettent d’encapsuler des volumes de solution beaucoup plus importants que dans les SUVs, du femtolitre au picolitre. Les liposomes peuvent de manière très stable contenir des molécules alors qu’ils sont suspendus dans une solution aqueuse, permettant ainsi un contrôle de l’environnement interne du liposome. De par leur taille, ils peuvent servir de conteneur « déplaçable » et permettent de réaliser des réactions de manière contrôlée (Kulin et al., 2003). Elles ont donc été extensivement utilisées comme microréacteur permettant la réalisation de réactions en milieu confiné, où des phénomènes oscillatoires d’activité ou de stabilité accrue des enzymes peuvent être observés (Wang et Yau, 2007). Les réactions ont pu être contrôlées en ajoutant les réactifs au départ, comme avec l’encapsulation d’un système d’expression de protéine (Saito et al., 2009), par diffusion sélective de réactifs à travers la membrane depuis la solution extérieure, par fusion de liposomes ou encore grâce à la création d’un réseau de nanotubes lipidiques entre plusieurs vésicules (Karlsson et al., 2001).
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Figure 4.6 : Représentation schématique des différents types de modifications qui ont pu être apportées à des GUVs. Au centre de la GUV se trouvent les différents éléments issus de cellules qui ont pu être encapsulés pour réaliser des études. A la périphérie se trouvent les différents types de modification qui ont pu être apportées à la membrane (Fenz et Sengupta, 2012).
Une des applications les plus évidentes des GUVs est l’étude des propriétés physico-chimiques des membranes biologiques. Ces applications incluent l’étude des propriétés mécaniques des vésicules entières (Svetina et Žekš, 2002), comme l’étude de l’élasticité, la force et la perméabilité à l’eau de la bicouche contenant des lipides formant des micro-domaines (Rawicz et al., 2008), l’étude des propriétés mécaniques de la membrane (Portet et Dimova, 2010) en fonction de sa composition lipidique (Rawicz et al., 2008), de la formation de domaine lipidique [Figure 4.7] (Veatch et Keller, 2005)(Wesołowska et al., 2009), de la dynamique des lipides, ainsi que des phénomènes physiologiques comme la croissance membranaire, le bourgeonnement, la fusion et la fission des membranes [Figure 4.8].
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Figure 4.7 : Vésicules géantes de 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), Palmitoyl Sphingomyéline (PSM) et Cholestérol à 25 °C. Les vésicules sont imagées avant la coalescence complète des domaines. A l’examen des fractions de phases claires et sombres sur les vesicules, il peut être estimé que la phase sombre est riche en PSM et Chol alors que la phase claire est riche en DOPC. Les barres d’échelles de ces images en microscopie optique sont de 20 µm. (Veatch and Keller, 2005)
Dans leur étude, Tanaka et al., se proposent d’étudier l’insertion d’un lipide à longues chaînes carbonées, la lysophosphatidylcholine (Lyso-PC), dans la membrane de GUVs et l’influence que cela peut avoir sur la déformation de celles-ci [Figure 4.8].
Figure 4.8 : Changement de forme d’une GUV (DPPC/40% cholestérol) grâce à l’addition de lyso-PC 1 µM à 20 °C. L’ovoïde change de forme pour prendre une forme de poire puis la forme de deux sphères asymétriques reliées par un pont. (1) 0s, (2) 17s, (3) 18s, (4) 40s correspondent au temps d’acquisition des images après injection de la solution de 1 µM de lyso-PC. Après l’arrêt d’addition de lyso-PC, (5) 240s, la distance entre les deux sphères a augmenté avec le temps. Images de microscopie optique, barre d’échelle : 10µm (Tanaka et al., 2004)
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L’étude des membranes des GUVs ne se limite pas à l’influence de la composition lipidique mais aussi aux interactions potentielles avec des protéines présentes dans le milieu (Roux et al., 2010) ou incluse dans la membrane (Boulbitch et al., 2001)(Aimon et al., 2011).
Une tendance récente liée à l’utilisation des GUVs est la recherche de la reconstitution de cellules artificielles. En effet, avec l’avènement de la biologie synthétique et le développement toujours plus poussé des outils de biologie moléculaire, des équipes ont réussi par exemple à synthétiser des génomes complets pour les injecter dans leur cellule hôte dénuée de génome (Gibson et al., 2008)(Lartigue et al., 2009)(Gibson et al., 2010). Au-delà de ces prouesses, c’est surtout la notion de cellule minimale ou de proto-cellule qui s’applique directement aux GUVs. Plusieurs équipes à travers le monde cherchent à fabriquer une cellule minimale capable de répliquer son « génome » (Kita et al., 2008) ou même de se multiplier de façon indépendante (Kurihara et al., 2011). Le couplage de ces systèmes avec des milieux d’expression « cell-free » pourrait permettre de produire des systèmes réplicatifs, si toutefois un génome minimal est mis au point.
Quelle que soit l’étude visée, il est souvent requis de préparer des vésicules géantes unilamellaires de taille et de forme bien définies. C’est pourquoi, diverses techniques ont été développées depuis la première production de vésicules in vitro.
Les contraintes techniques et expérimentales de mes travaux de thèse, en plus de l’expertise que possède le laboratoire dans la production de vésicules, nous ont orientés vers l’utilisation des vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Aussi, je me limiterai au cours de cette deuxième partie, consacrée à la production des vésicules, à la description des techniques permettant la production des GUVs.
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