Applications d’agents de compaction photosensibles en « Cell-free »

Comme souligné précédemment, il est souvent impossible d’implémenter un système synthétique in vivo. Ceci est particulièrement vrai lorsqu’il est question par exemple de compaction non spécifique de l’ADN, car cela affectera la viabilité cellulaire. L’utilisation de systèmes CFPS libère l’expérimentateur de la limitation liée à la viabilité cellulaire. De plus, les réactions lancées sont accessibles in situ permettant ainsi de réaliser des modifications en temps réel sur les réactions. Ces deux paramètres font des systèmes CFPS des candidats idéaux pour étudier les réseaux de régulation et le contrôle de l’expression génétique par des molécules non compatibles avec le vivant comme les surfactants photosensibles.

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Il a ainsi été montré qu’en fixant deux polyamines photosensibles sur des sites spécifiques du promoteur T7, il est possible de contrôler l’expression du gène en aval de ce promoteur. Dans le cas présent, il s’agit de motifs azobenzène photoisomérisables, cette caractéristique leur permettant de changer de conformation sous l’influence d’une impulsion lumineuse. En fonction de la longueur d’onde utilisée, les molécules prendront soit une conformation cis (λ<400 nm) engendrant un encombrement stérique qui déstabilise le duplex d’ADN (Robertson, 1939), soit une conformation trans (λ=450 nm) permettant l’intercalation des molécules trans entre les paires de bases et ainsi de stabiliser la double hélice d’ADN (Asanuma et al., 1999). La déstabilisation permettra à la transcription d’avoir lieu alors que la stabilisation empêchera l’ARN polymérase d’initier la transcription [Figure 2.4] (Kamiya et al., 2015).

Figure 2.4 : Illustration de la photorégulation réversible de la transcription grâce à l’utilisation d’un promoteur modifié par deux azobenzènes. Dans ce système, les azobenzènes trans s’intercalent entre les paires de bases et stabilisent la double hélice. Dans leur conformation cis (molécule coudée), les molécules déstabilisent le duplex d’ADN (Kamiya et al., 2015).

Au laboratoire nous avons cherché à placer le contrôle de la transcription et de la traduction d’une protéine sous un photocontrôle efficace. En effet, les protéines recouvrent une large gamme de fonctions permettant d’agir sur leur environnement. Il est donc intéressant d’être en mesure de proposer des modes de régulation spatio-temporelle pour celles-ci. Habituellement, les modes de photocontrôle proposés impliquent l’introduction de biomolécules (ARN, ADN, Protéines…) modifiées chimiquement afin de pouvoir établir ce contrôle. Dans le cas présent, l’équipe a développé des molécules photosensibles dans le but de pouvoir contrôler la compaction de l’ADN par la lumière, sans avoir à introduire des modifications chimiques sur les éléments biologiques présents dans le système (Estévez-Torres et al., 2009).

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La stratégie repose sur une compaction de l’ADN photo-régulée grâce à l’ajout dans le milieu d’expression reconstitué (CFRPS) de l’AzoTAB, un tensioactif cationique photosensible [Figure 2.5].

En effet, les propriétés de l’AzoTAB à l’échelle moléculaire, à savoir l’isomérisation trans-cis provoquée par une exposition UV et l’isomérisation inverse cis-trans due soit à une relaxation thermique, soit à une exposition à la lumière bleue, se traduisent par une modulation de la conformation de l’ADN [Figure 2.5].

Figure 2.5 : Stratégie mise au point au sein de l’équipe, permettant le contrôle de l’expression génétique par la lumière et basée sur le photocontrôle de la compaction de l’ADN (Estévez-Torres et al., 2009). L’exposition du système à un stimulusl lumineux permet de passer d’un état de compaction à l’autre. L’état décompact permet de réaliser les étapes de transcription et de traduction, alors que l’état compact de l’ADN ne le permet pas.

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Dans sa conformation trans, l’AzoTAB induira la compaction de l’ADN dans le milieu d’expression rendant la séquence du gène d’intérêt présent sur le plasmide inaccessible à la machinerie de transcription. De cette façon, son expression est inhibée et la protéine codée par ce gène n’est donc pas produite. Dans sa conformation cis, l’AzoTAB n’entrainera pas de compaction de l’ADN, permettant ainsi à la machinerie de transcription d’accéder au promoteur T7 et de commencer à produire des ARNm correspondants à la protéine codée par le gène présent sur le plasmide [Figure 2.6].

Figure 2.6 : Isomérisation de l’agent de compaction AzoTAB. Une solution composée majoritairement d’isomères trans interagit fortement avec les molécules d’ADN. L’ADN et l’ARN sont alors dans un état compact et les étapes de transcription-traduction n’ont pas lieu. L’isomère cis a une faible affinité pour l’ADN. Une solution riche en isomères cis permet ainsi aux molécules d’ADN d’être sous forme relâchée permettant ainsi aux machineries de production de protéines d’accéder à la séquence d’ADN.

Au laboratoire, il a été décidé de travailler sur la β-lactamase, une enzyme présente chez les bactéries résistantes aux antibiotiques de la catégorie des β-lactamines. L’idée initiale derrière le choix de cette enzyme était la possibilité d’utiliser la β-lactamase pour convertir des prodrogues non toxiques, tels que le Protax et/ou Prodox, en molécules anticancéreuses fortement cytotoxiques, respectivement le Taxol (Rodrigues et al., 1995) et la Doxorobucine.

Ce choix n’était pas anodin car nous travaillons avec un système CRFPS dérivé du PURE system ® qui est issu d’E. Coli. Il y avait donc de très grandes probabilités pour que le système produise une enzyme fonctionnelle. De plus, l’utilisation de la β-lactamase permet d’utiliser un rapporteur chromogénique bien connu des biologistes pour détecter la présence et l’activité de cette catégorie d’enzymes [Figure 2.7] (Venancio-Marques et al., 2012).

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Figure 2.7 : L’assemblage du milieu d’expression photosensible avec un plasmide codant pour la β-lactamase permet de contrôler la production de celle-ci et ainsi de pouvoir déclencher la conversion de son substrat grâce à une source d’énergie lumineuse.

Il a ainsi pu être démontré au laboratoire dans un premier temps la possibilité de réguler l’activité du milieu d’expression et donc de la production de la protéine par l’exposition des échantillons à des lumières de différentes longueurs d’ondes. Grâce à la fonction protéique de la β-lactamase et à la nitrocéfine, l’activité de l’enzyme a pu être mise en évidence et étudiée en fonction de la concentration en AzoTAB, et des conditions d’éclairement. Il a pu être démontré qu’il était possible de mettre en place une photorégulation de la conversion du substrat de la β-lactamase. La flexibilité de la méthode permet un contrôle dynamique de l’expression de la protéine en se basant sur la réversibilité de l’isomérisation et l’état de compaction concomitant de l’ADN. Finalement, la précision spatiale du signal lumineux utilisé se traduit par une grande précision spatiale dans le déclenchement des réactions enzymatiques (Venancio-Marques et al., 2012).

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2. Régulation par voie métabolique ou antibiotique