Les cellules d’insectes et de mammifères

La culture de cellules animales est le système le plus comparable au modèle humain lorsqu’on en vient aux motifs et capacités de modifications post-traductionnelles de l’appareil cellulaire. Néanmoins, leur culture plus complexe et coûteuse représente un réel désavantage, d’autant plus que les rendements de production ne sont pas aussi élevés que ceux des modèles précédemment cités.

1.2.2.3.1 Système Baculovirus-cellules d’insecte

Le système d’expression basé sur l’infection par des vecteurs Baculovirus (BEVS) de culture cellulaire d’insecte, créé au début des années 1980, est le plus versatile et le plus utilisé pour la production de protéines eucaryotes. Il a été utilisé pour produire avec succès plusieurs protéines recombinantes, des protéines thérapeutiques, mais aussi des structures virales plus complexes telles que les Virus-Like Particles (VLPs) dont le sujet sera discuté plus tard, dans le cadre des applications des systèmes « cell-free » [section 2.6].

La production de protéines recombinantes via BEVS se réalise en deux étapes. Une première étape de croissance cellulaire puis une infection par le Baculovirus. Comme d’autres virus, celui-ci va prendre le contrôle de la machinerie d’expression de la cellule hôte et Les champignons possèdent un système de modifications post-traductionnelles plus proche de celui des eucaryotes supérieurs. Néanmoins, leur physiologie fait qu’il est plus difficile de produire des souches stables d’expression.

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déclencher les cascades de production, qui en temps normal permettraient au virus de se répliquer mais qui dans le cas présent permettent d’obtenir la protéine cible sans réplication du virus.

Ces cellules ont l’avantage d’être moins sujettes au stress et permettent donc une manipulation plus aisée des cultures, en plus d’être plus productives et moins coûteuses à entretenir que le modèle mammifère.

Plusieurs désavantages sont à noter, en partie dû à l’infection par le Baculovirus :

- Un traitement inefficace et une détérioration des capacités de repliement et de sécrétion des protéines (McCarroll and King, 1997).

- Une haute activité des protéases, en partie encodées par le virus nécessitant alors l’usage d’inhibiteurs dans le milieu de culture ou le développement de nouveaux vecteurs viraux (Ikonomou et al., 2003).

- Une expression faible et des variations au niveau des motifs de modifications post-traductionnelles qui sont normalement retrouvés dans les conditions physiologiques.

1.2.2.3.2 Les cellules de mammifères

Les systèmes mammifères comme les cellules CHO (Ovariennes d’Hamster Chinois) ou les cellules HEK (Rein Embryon Humain), sont considérés comme étant des lignées plus stables génétiquement et avec de meilleurs rendements de transformation et de croissance, quel que soit le moyen de culture choisi (en adhérence ou submergé).

Ces types cellulaires présentent le grand avantage d’offrir un spectre de modifications post-traductionnelles identique aux modèles eucaryotes supérieurs (Gervais et al., 2003). Ces cellules permettent un niveau de repliement et de formation de ponts disulfures qu’aucun modèle précédemment cité ne peut atteindre. Leur appareil de glycosylation permet une fonctionnalisation variée des protéines qui n’est pas uniquement dépendante des protéines mais aussi des conditions d’expression, comme le pH, la température, les nutriments, le taux Avant l’utilisation de cellules de mammifères, les cellules d’insecte infectées par Baculovirus représentent le modèle le plus proche pour l’expression de protéines d’eucaryotes supérieures nécessitant un ensemble de modifications post-traductionnelles complexes comme les ponts disulfures et la N-glycosylation.

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d’oxygène, l’hôte d’expression, etc.(Butler, 2006) Ceci permet un contrôle très précis de la modification des protéines recombinantes.

Dans certains cas, l’expression en modèle mammifère est la seule solution viable pour obtenir des protéines correctement modifiées. L’exemple de l’expression du transporteur de la sérotonine du rat dans différents modèles a montré dans le cas présent les limites de chaque modèle lors de l’expression de protéines hétérologues :

- Chez E. Coli la protéine était partiellement dégradée, - Chez Pichia (Levure), le repliement n’était pas correct,

- Le modèle insecte produisait une protéine avec un motif de glycosylation incorrect.

1.2.3 Systèmes d’expression à base d’extraits cellulaires et systèmes reconstitués Les systèmes de synthèse de protéines « cell-free » (CFPS) dérivés d’extraits cellulaires sont utilisés depuis des décennies comme des outils de recherche en biologie fondamentale et appliquée. Ils ont joué un rôle tout particulier dans la découverte du code génétique lors des expériences pionnières de Nirenberg et Matthaei (Nirenberg et Matthaei, 1961)(Martin et al., 1962). Depuis leurs balbutiements, ces systèmes ont beaucoup évolué au regard de leur méthode de production ou même en fonction du type d’organisme dont ils sont issus. Il est surtout notable qu’il existe aujourd’hui des systèmes entièrement reconstitués (CFRPS) à partir des éléments manuellement purifiés des machineries cellulaires.

Plus récemment, les CFPS (systèmes de synthèse de protéines « cell-free ») se sont révélés être des outils de premier ordre dans le cadre des technologies de synthèse protéique (Katzen et al., 2005)(Swartz, 2006), incluant la production de protéines thérapeutiques (Goerke and Swartz, 2008)(Kanter et al., 2007)(Yang et al., 2004)(Zawada et al., 2011), et la Les cellules mammifères possèdent toutes les caractéristiques afin de réaliser des modifications post-traductionnelles sur des protéines comportant des motifs identiques à ceux des eucaryotes supérieurs. Qu’il s’agisse de lignées d’expression stables ou transitoires, elles présentent les désavantages d’être coûteuses et de comporter des étapes de mise en culture et de multiplication plus longues. De plus, les rendements d’expression sont nettement inférieurs aux modèles présentés précédemment.

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production haut-débit de bibliothèques de protéines dans le cadre d’études de l’évolution des protéines et de génomique structurelle (Goshima et al., 2008)(Griffiths and Tawfik, 2003).

Pour produire des protéines d’intérêt, les systèmes CFPS intègrent un ensemble de composants catalytiques pour la production d’énergie et la synthèse de protéines à partir d’un lysat de bactéries, de cellules animales ou végétales [Figure 1.12]. Ces lysats contiennent les éléments nécessaires à la transcription, traduction, au repliement des protéines et au métabolisme énergétique : ribosomes, acides ribonucléiques de transfert (ARNt), aminoacyl-ARNt synthétase, les facteurs d’initiation et d’élongation de la traduction, les facteurs de relâchement ribosomal « ribosome release factors », les enzymes de recyclage des nucléotides, des voies métaboliques, des protéines chaperonnes, etc.

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Figure 1.12 : Le système CFPS. Une production efficace de protéines recombinantes nécessite la présence d’ARNt (Acides ribonucléiques de transfert), d’énergie, de facteurs de traduction et la transcription d’ARNm. Cette dernière requiert la présence d’ADN, de ribonucléotides et d’enzymes tels que l’ARN polymérase T7 ou SP6. La traduction requiert des facteurs d’initiation, d’élongation et terminateurs de la traduction ainsi que les composants nécessaires à l’aminoacylation des ARNt tels que les ARNt et l’ATP. Le système de régénération d’énergie a besoin d’enzymes et de leurs substrats comme la Phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) / le phosphoénolpyruvate (PEP), la créatine kinase (CK) / la phosphocréatine (PC). Les extraits cellulaires comportent les facteurs de traduction et les enzymes pour l’aminoacylation, alors que dans les systèmes reconstitués, les éléments purifiés sont ajoutés individuellement.

Ces éléments catalytiques agissent au sein du lysat cellulaire pour produire et replier les produits protéiques désirés. Cette production est soumise à l’incubation du lysat avec des substrats essentiels, comprenant les acides aminés, les nucléotides, l’ADN ou l’ARNm codant la protéine cible, les substrats énergétiques, les cofacteurs, ainsi que les ions.

Une fois le système CFPS ou CFRPS “démarré”, il va continuer de produire la protéine cible jusqu’au moment où un des substrats (ATP, cystéine, etc.) est totalement consommé ou que la concentration de produits intermédiaires de réaction (phosphates inorganiques) ait atteint un seuil critique d’inhibition.

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Bien que n’importe quel organisme puisse fournir un lysat, les systèmes d’expression « cell-free » les plus communs sont obtenus à partir d’extraits provenant d’Escherichia Coli (ECE), de Réticulocytes de lapins (RRL), de germes de blé (WGE), et de cellules d’insectes (ICE). Sachant que ces cellules ont des propriétés intrinsèques singulièrement différentes, comme nous avons pu le voir lors de la présentation de certains modèles d’expression, les lysats qui en sont obtenus ont donc des comportements tout aussi particuliers.

Par conséquent, il faut choisir avant tout la source du lysat en fonction de la protéine biologiquement active que nous cherchons à produire en utilisant un système CFPS.

Cette décision est prise naturellement en considérant la disponibilité du matériel, la facilité de préparation de l’extrait, le rendement protéique nécessaire, l’origine et la complexité de la protéine, les procédés mis en jeu en aval de la production et les coûts.

Comme pour les systèmes d’expression vivants vus précédemment, il existe deux classes de systèmes CFPS, les procaryotes et eucaryotes.