Le système de gel est constitué d’une chambre de réaction (R) et d’une partie
plus étroite contenant la matrice de gel (G). La chambre de réaction contient un
antisérum humain polyspécifique (en haut) ou monospécifique (en bas) contre
les immunoglobulines ou les facteurs du complément C3c/C3d. Les érythrocytes
du patient sont ajoutés et brièvement incubés dans cette chambre de réaction,
puis la carte contenant les colonnes est centrifugée. S’il y a eu agglutination des
érythrocytes du patient dans la chambre de réaction, ceux-ci sont retenus dans
la matrice de gel et le test est positif (flèche). En absence d’agglutination, les
érythrocytes centrifugés traversent la matrice de gel sans grande résistance et
sédimentent au fond de la colonne. Le test est négatif.
• Interprétation du test de Coombs
Un TCD positif de type IgG ou IgG + C3d reflète le plus souvent un AAc chaud. La positivité de type C3d isolée traduit habituellement un AAc froid de type IgM [52]. Dans les AHAI mixtes, le TCD est de type IgG + C3d [59].Dans les anémies hémolytiques à TCD positif autres que l’AHAI, on retrouve les allo-immunisations post-transfusionnelles et la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN). Dans ces cas, l’Ac est monospécifique est dirigé contre un Ag absent de la surface des GR du malade. Lorsque le témoin auto est positif avec un contexte de transfusion récente (< 4 mois), l’implication d’un allo-Ac doit être envisagée avant celle d’un AAc.
Un TCD négatif ne permet pas d’éliminer le diagnostic d’AHAI.Il doit être refait à l’aide d’une anti globuline humaine (AGH) anti-IgA [52]. Par ailleurs, il est impératif d’éliminer les causes d’hémolyses corpusculaires, ainsi que les causes d’hémolyses acquises pour pouvoir retenir le diagnostic d’une AHAI à TCD négatif [31].
Inversement, en l’absence de signes d’hémolyse, un TCD positif n’a pas toujours de valeur pathologique [52]. Cette positivité est faible ou microscopique. Elle implique des IgG qui ne réagissent pas après une élution [60].Il est important de noter que l’intensité de la positivité du TCD n’est pas toujours corrélée à l’intensité de l’hémolyse [61].
Figure 9 : Test direct à l’anti globuline (Coombs direct) monospécifique. [1]
Si le test de Coombs polyspécifique est positif, d’autres tests sont effectués pour définir plus précisément les éléments déposés sur les érythrocytes du patient. Pour cela, les érythrocytes du patient sont incubés avec un antisérum monospécifique réagissant avec les IgG, les IgA, les IgM ou avec le facteur du complément C3c ou C3d. Un test positif (agglutination par un ou plusieurs antisérums) montre la présence du composant correspondant sur les érythrocytes du patient. [1]
Si le test détecte des auto-anticorps de type IgG sans C3c ni C3d, il s’agit d’un auto-anticorps de type IgG qui n’active pas le complément. Si, par contre, le test détecte en plus le C3c et/ou le C3d, il s’agit d’un auto-anticorps qui active le complément.
Les deux situations sont typiques des auto-anticorps de type «chaud». La détection d’un dépôt de complément isolé sur les érythrocytes peut indiquer la présence d’un auto-anticorps de type «froid» (IgM), de type «chaud» (IgM, IgA) ou bi phasique, ce qui nécessitera des examens diagnostiques complémentaires.
Une analyse suivante cherchera à identifier des auto-anticorps de type IgM ou IgA. Toutefois, la méthode classique du TDA avec un antisérum monospécifique réagissant avec les IgM ou les IgA donne généralement de maigres résultats.
Les auto-anticorps de type IgA sont très rares, ont une amplitude de température optimale à 37 °C et peuvent provoquer des hémolyses fulminantes.
Les auto-anticorps de l’isotype IgM sont difficiles à déceler, vu qu’en raison de leur taille pentamère, ils sont souvent éliminés par lavage pendant l’exécution du test. En outre, l’amplitude de température de l’anticorps et la température à laquelle le TDA est effectué jouent un rôle décisif dans la mise en évidence d’un auto-anticorps de type IgM. L’étape suivante exploite la capacité des IgM, due à leur structure (pentamère) et à leur taille, d’agglutiner les érythrocytes sans facteurs d’aide supplémentaires. On incube le sérum du patient à 16 °C en présence d’érythrocytes-test.
Une agglutination spontanée des érythrocytes-test indique la présence très probable d’un auto-anticorps «froid»de type IgM. Si ce test est également positif à30°C, il ya lieu de supposer que l’auto-anticorps est potentiellement important sur le plan clinique.
Il s’agira alors de déterminer si l’auto-anticorps est potentiellement capable d’induire une hémolyse. Des érythrocytes-test prétraités, beaucoup plus sensibles à la lyse par le complément que les érythrocytes-test conventionnels, sont incubés en présence de sérum du patient à 16 °C (A) et à 30 °C (B)
(X: témoin). Après ajout d’une source de complément sous forme de sérum standard frais, on incube les érythrocytes-test à 37 °C. S’il y a lyse des érythrocytes, on conclut à la présence d’un auto-anticorps froid d’importance clinique, potentiellement capable d’induire une hémolyse intra vasculaire chez le patient. Dans de rares cas, un auto-anticorps peut déclencher une hémolyse fulminante même avec des érythrocytes non prétraités.[1]
Figure 10: Détection d’auto-anticorps hémolysants. [1]
Si tel est le cas, on conclut à la présence d’un auto-anticorps «froid» d’importance clinique, potentiellement capable d’induire une hémolyse intra vasculaire chez le patient.
Les auto-anticorps responsables d’hémolyses intra vasculaires fulminantes ont le potentiel de lyser in vitro les érythrocytes non prétraités.
Les conditions préanalytiques jouent un rôle décisif dans la confirmation d’une suspicion d’auto-anticorps d’importance clinique de type froid. Le sang doit être maintenu à 37 °C dès le prélèvement et pendant toute la procédure de traitement. Des températures plus basses pendant le traitement font courir le risque que les auto-anticorps IgM soient adsorbés par les érythrocytes et ne puissent plus être décelés qu’à de faibles concentrations dans le sérum. [1]
• Limite du test direct à l’anti globuline :
Même en présence d’un test positif, celui-ci doit être interprété dans le contexte clinique car un test positif se rencontre chez 1/1000 des sujets en bonne santé et 0,5 à 8 % des patients hospitalisés, alors même qu’il n’y a pas d’anémie hémolytique.
Faux positifs
• La positivité du test de Coombs peut s’observer en dehors d’une hémolyse auto-immune, particulièrement après transfusion sanguine, à la suite d’injection de produits thérapeutiques d’origine humaine
(Ig IV) ou animale (sérum anti lymphocytaire).
• Il est exceptionnel d’observer un test de Coombs positif en l’absence d’hémolyse auto-immune bien que la présence d’IgG ou de certaines fractions du C ait pu être décrit chez les sujets normaux.
• Un test de Coombs direct positif ne signifie pas obligatoirement AHAI (nombreux faux positifs.) peut notamment s’observer en cas d’adsorption non spécifique d’Ig dans diverses circonstances (hypergammaglobulinémie polyclonale, autre MAI, suites de l’administration d’Ig polyvalentes, myélome...) ou encore en cas d’anémie hémolytique de mécanisme immunologique induite par un médicament
Faux négatifs
A l’inverse, le TDA peut être faussement négatif dans d’authentiques AHAI (~ 5 % des AHAI) :
• Lorsque les auto-anticorps sont présents en quantité trop faible (< 150-200 par GR) ;
• Lorsque l’affinité de l’auto-anticorps est faible et que celui-ci est éliminé lors du lavage des GR ;
• En raison d’un problème et/ou d’une erreur technique : lavage insuffisant des GR, test réalisé sur échantillon de sang non fraîchement prélevé (qui peut induire surtout une fixation isolée de C3) ;
• Lorsqu’il s’agit d’un AC de type IgA, ce qui est le cas dans environ 2 à 3 % des AHAI.Ce qui explique la nécessité de demander systématiquement un TDA avec une anti-globuline anti-IgA lorsque le test est négatif en IgG et C3 [64].
Le diagnostic d’AHAI à TDA négatif stricto sensu ne peut donc être retenu qu’après avoir exclu les autres causes d’anémies hémolytiques constitutionnelles ou acquises, pouvant se révéler à l’âge adulte et doit être remis en question en l’absence de réponse à une corticothérapie « d’épreuve » [2,63].
3. Test de Coombs indirect (TCI)
Il permet, de confirmer la présence d’un auto-anticorps dans le sérum, de préciser la nature de l’AC en cause (IgM ou IgG) (figure 11), d’analyser l’optimum thermique de l’AC, d’étudier la spécificité de l’auto-anticorps, de rechercher la présence de l’hémolysine, d’apprécier dans le temps le titre de l’auto-anticorps et d’en suivre l’évolution sous traitement.
L’absence d’auto-anticorps sérique ne permet pas d’écarter la nature auto-immune d’une hémolyse. Les AF sont recherchées par une réaction d’agglutination en tube à4°C.
Le TCI recherche les auto-anticorps anti-érythrocytaires présents dans le sérum du patient. On incube des érythrocytes-test standardisés en présence de sérum du patient puis, dansune deuxième étape, on ajoute du sérum antihumaindit «polyspécifique» qui réagit avec les anticorps de type IgG et avec le complément (C3d). Si le sérum du patient contient des anticorps qui auront sensibilisé les érythrocytes-test au cours de la première étape, le sérum antihumain provoque une agglutination et le test est positif.[65]