Autres tests :

a. Tests d’élution et adsorption

Le caractère auto-immun et le type de revêtement érythrocytaire sera souvent précisé à partir de l’épreuve adsorption-élution avec les globules autologues et des globules homologues. Cela est parfois nécessaire pour distinguer entre les autos et les allo anticorps en situation pré et post-transfusionnelle.

L’élution consiste à détacher les anticorps fixés sur les hématies en utilisant des moyens physiques (chaleur) ou chimiques(éther, acide) [27]. L’élution des agglutinines froides est opérée à la chaleur (56 ◦C). Les IgG chaudes sont habituellement éluées en milieu acide

[66]. L’éluat est ensuite testés contre des hématies phénotypées en utilisant la

technique de Test de Coombs indirect (TCI) et la technique enzymatique [56].

Le test d’élution n’est pas indispensable au diagnostic, il est rarement réalisé en pratique courante. Cependant, il permet de confirmer la présence d’un auto anticorps( AAc) , d’étudier sa spécificité et de distinguer les AAc des alloanticorps [44].

b. Gel test

Le gel test est la technique de choix qui a remplacé la technique en tube .En effet, la technique de gel filtration évite les lavages trop agressifs pouvant éluer les autoanti-corps de faible affinité.Il convient d’utiliser :

• des antiglobulines anti-IgG, IgM et IgA.

• des anticorps contre les fractions du complément C3d etC3c.

Les anticorps (anti-sérum) et les érythrocytes sont d’abord incubés dans une chambre de réaction, puis les microtubes sont centrifugés. S’il y a eu agglutination, l’agglutinat est retenu au passage dans les billes de gel et le test est positif. En absence d’agglutination, les érythrocytes peuvent traverser sans encombre la couche de billes de gel et se retrouvent après centrifugation au fond du microtube. Le test est alors négatif

Ainsi, les anémies hémolytiques auto-immunes à test deCoombs négatif sont devenues rares avec la technologie engel. Cependant, il en existe et plusieurs autres moyenspermettent d’apporter des indices en faveur d’une auto-immunisation dans les anémies hémolytiques.[45]

Deux études n’ont pas démontré de supériorité significative par rapport à la technique en gel

[67], de sorte que cette dernière reste l’examen biologique de référence. La cytométrie en

flux appliquée au TCD (FC-TCD) estune technique quantitative qui permet d’apprécier la quantité d’Ac ainsi que les fractions du complément à la surface du globule rouge. Elle présente une sensibilité très élevée (30 à 40 AAc/GR). En effet, elle permet de détecter des AAc à la surface des GR des patients atteint d’AHAI ayant un TCD négatif[61].

d. Étude du sérum

L’étude du sérum est moins spécifique que le TCD [52]. Eneffet, elle a l’avantage de dépister l’association d’agglutininefroide observée dans 20 à 30 % des AHAI chaudes

[68].Elle comporte une première étape de dépistage utilisant unegamme de GR de

groupe O comportant des antigènes et desphénotypes obligatoires, selon le principe du test indirect àl’antiglobuline ou en milieu de basse force ionique « low ionicstrength saline » (LISS).

Lorsque le dépistage est positif, on procède à une identification de l’Ac à l’aide d’une gamme d’hématies-tests de groupeO, de répartition antigénique définie et réglementée. L’identification est effectuée en test indirect à l’antiglobulineanti-IgG (TCI) et peut être complétée par une technique enzymatique (traitement à la papaïne, broméline et accessoirement auxneuraminidases). Il est possible d’étendre l’identification à uneétude de l’optimum thermique en explorant plusieurs températures, ainsi qu’à une détermination du titre [68].L’amplitude thermique est déterminée en testant le sérumvis-à-vis de GR O à 4

◦C, 22 ◦C et 37 ◦C. L’optimum thermique correspond à la température qui donne le

titre le plus élevé. Letitre est égal à l’inverse de la dernière dilution positive obtenue à l’optimum thermique [70].Les AAc chauds reconnaissent le plus souvent des Ag Rhésus non restreints et sont responsables d’une positivité vis-à-vis de toutes les hématies du panel. Cependant, ils peuvent adopter un comportement pseudo-allotypique. Rarement une spécificité restreinte peut être attribuée à ces AAc. Dans ce cas la spécificité « e » du système Rhésus est la plus rencontrée [71].

• Le test de Donath-Landsteiner

Ce test permet de mettre en évidence la présence d’hémolysine de Donath-Landsteiner en exploitant sa propriété biphasique.Le sérum est recueilli et maintenu à 37 ◦C. Il est ensuite mélangé à du sérum frais (source de complément) et des GR O porteurs de l’antigène P. Une première incubation à +4 ◦C est effectuée suivie d’une incubation à 37

◦C. Après centrifugation, une hémolyse est en faveur d’un sérum positif.

Il faut savoir que les agglutinines froides à large amplitude thermique peuvent donner de faux positifs [27,53].

• Recherche d’hémolysine acide et neutre

On désignepar « hémolysine » les AAc froids ou chauds capables d’induireune activation du complément de C1 à C9 et de produire unehémolyse in-vitro.La présence d’autohémolysines dans le sérum du patient est corrélée à un taux de mortalité élevé. Il est donc important deles rechercher.

Le sérum est d’abord décomplémenté à 56 ◦C pendant 30 min, puis additionné de sérum AB (source de complément) et de GR O tests traités et non traités à la papaïne. Cette opération est effectuée dans deux milieux différents : un milieu à pH acide (pH : 6,5– 6,8) et un milieu à pH neutre (pH : 7,3). L’opération est répétée à +4 ◦C, + 22 ◦C et +37 ◦C. Une réaction positive se traduit par une hémolyse [70].

• Titrage et détermination de la spécificité des agglutinines froides

La détermination de la spécificité des agglutininesfroides impose l’utilisation de GR papaïnés OI+ et OI−. Pourle titrage, plusieurs dilutions du sérum à +4 ◦C sont nécessaires[70].

• Recherche d’allo-anticorps

Les passages multiples à37 ◦C sur des hématies autologues ou homologues permettentl’adsorption des AAc chauds. L’adsorbat est ensuite étudié à larecherche d’un allo-Ac associé [72].Pour les AAc froid, le traitement par le dithiothréitol ou au2-mércaptoéthanol permet la dénaturation des IgM et des IgA.

e. Double test de Coombs (Dual DAT)

Présenté par Bartolmas et Salama en 2010, le double test deCoombs permet de détecter un revêtement par des IgM [74].

f. Monocyte monolayer assay

La difficulté de trouver un lien direct entre le test de Coombs et le degréd’hémolyse a conduit à la recherche d’autres tests plus àmême d’établir cetterelation.

Plusieurs tests fonctionnels cellulaires utilisant les propriétés d’adhérence, dephagocytose

[75] ou de lyse des hématies sensibilisées ont été mis au point. Letest d’ «

adhérence-phagocytose par les monocytes » (monocyte monolayerassay ou MMA), connu depuis longtemps [76], a été étudié de manièresystématique chez 159 patients ayant un test de Coombs positif pour vérifierla relation entre la sévérité de l’hémolyse in vivo et les résultats des testsfonctionnels in vitro. Sa faible valeur discriminante dans les AHAI « chaudes » ne peut lui donner une place de référence, même s’il est beaucoup plusperformant dans lesAHAI « froides » [77].

Dans ce test très sensible, mais de mise en œuvre délicate, il est nécessaire de purifier les monocytes d’un donneursain et de les mettre en présence des globules rouges dupatient [77]. En fin de test, on compte le nombre de monocytes ayant phagocyté des globules rouges en comparaisonavec des globules rouges témoins non sensibilisés. Un témoinpositif est indispensable avec des globules rouges Rh1 (D +)sensibilisés avec un sérum anti-D.

g. Mitogen stimulated DAT (MS-DAT)

Présenté par Barcellini et al. en 2010, ce test consiste àstimuler le sang total du patient avec des mitogènes T etB pour augmenter la sensibilisation des globules rouges parles autos anticorps produits par les lymphocytes B du patientet à pratiquer ensuite un test de Coombs direct quantitatif [78]. Les contrôles négatifs sont indispensables pour validerce test.