Dans cette section, un aperçu de l’impact de l’O2 sur les facteurs HIF est donné, en plus d’informations sur leurs particularités fonctionnelles. Il est aussi question des caractéristiques communes et distinctes entre les différents membres de cette famille, autant dans leurs domaines, que dans leur expression ou leur importance pour la réponse à l’hypoxie.
Chez les vertébrés, la famille des facteurs HIF est composée de trois membres distincts : HIF- 1, HIF-2 et HIF-3. Ces facteurs sont des hétérodimères, chacun formé d’une sous-unité α qui lui est propre (HIF-1α, -2α, -3α), ainsi que d’une sous-unité HIF-1β commune. Tout au long de ce manuscrit, cette dénotation sera respectée et la distinction sera maintenue entre les sous-unités et l’hétérodimère fonctionnel. De plus, les dénominations HIF et HIF-α seront utilisées pour identifier ces facteurs et leurs sous-unités α, respectivement, de manière générale et s’appliquera surtout à HIF-1/2 et HIF- 1α/2α, les protéines majeures dans la signalisation hypoxique.
Caractéristiques générales
Les sous-unités HIF-α et HIF-1β appartiennent au groupe des protéines bHLH-PAS, un sous- groupe de la famille des facteurs de transcription bHLH (basic helix-loop-helix) [163, 164]. Les facteurs bHLH-PAS sont généralement formés par la dimérisation d’une protéine régulée par des signaux (classe I, dont HIF-α) avec une protéine considérée comme non modulée (classe II, dont HIF- β). La sous-unité HIF-1β est considérée comme généralement stable, bien que ceci puisse varier d’un type cellulaire à l’autre (ceci sera discuté à la section 1.5.4). Les sous-unités HIF-α, quant à elles, sont finement régulées par des changements des niveaux d’O2 cellulaires [165, 166]. Grâce à cette
régulation, les facteurs HIF sont de réels médiateurs de la réponse à l’hypoxie.
1.5.1.1 Le domaine de dégradation dépendant de l’O2
Les niveaux protéiques des HIF-α sont très faibles, voire presque indétectables, en conditions oxygénées, malgré le fait qu’elles soient constitutivement exprimées [166, 167]. Ceci est le résultat de leur haute instabilité. Les sous-unités HIF-α ont en fait une demi-vie drastiquement courte, inférieure à 5 minutes en conditions oxygénées [167]. Cet état d’instabilité est médié par une famille d’enzymes à activité prolyl-hydroxylase, les PHD (prolyl hydroxylase domain-containing proteins), dont l’activité catalytique est directement dépendante de la présence d’O2. Ces enzymes modifient
des acides aminés précis au sein du domaine caractéristique des protéines HIF-α : le domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (domaine ODD ; oxygen-dependent degradation domain) [168, 169]. Le domaine ODD est hautement conservé entre les sous-unités HIF-α. Ce domaine, ainsi que sa régulation par les PHD, fait l’objet de la section 1.6.1. Conséquemment, en conditions oxygénées,
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une dégradation très rapide des sous-unités HIF-α est observée (Figure 1.8A). Lors d’une diminution des niveaux d’O2, le mécanisme menant à la dégradation des HIF-α est levé, permettant leur
accumulation rapide et graduelle (Figure 1.8B) [170]. Ainsi, en conditions d’hypoxie, les HIF-α stabilisées transloquent rapidement au noyau grâce à leurs séquences de localisation nucléaire (NLS ; nuclear localisation signal), afin d’interagir avec leur partenaire HIF-1β [171]. L’hétérodimère HIF- α/HIF-1β actif peut ainsi se former et réguler la transcription de gènes. Les particularités de ce mécanisme de régulation assurent une réponse rapide à des changements d’O2, soulignant
l’importance du maintien de l’homéostasie cellulaire de l’O2. De nombreux autres niveaux de
régulation s’ajoutent en parallèle, afin de permettre une activité adéquate des complexes HIF et afin d’apporter un contrôle précis de ceux-ci en fonction du stress et du contexte cellulaire. Ces mécanismes additionnels seront élaborés dans la section 1.6.
Figure 1.8: Les cinétiques de dégradation et stabilisation des HIF-α.
(A) Dégradation rapide de HIF-1α et HIF-2α lors de la réoxygénation de cellules HeLa ayant préalablement été exposée à de l’hypoxie (4h à 1 % O2). (B) Stabilisation rapide de HIF-1α et HIF-2α lors d’exposition de cellules
à des conditions hypoxiques (1 % O2). Hyp : hypoxie; Nor : normoxie. Résultats de V.N. Lafleur.
1.5.1.2 Les domaines fonctionnels des sous-unités HIF
La dimérisation et la liaison à l’ADN de chaque sous-unité des HIF sont médiées par leur domaine bHLH situé en extrémité NH2-terminale (Figure 1.9). Le domaine bHLH est constitué de
deux éléments, soit le domaine de dimérisation HLH et le court motif basique médiateur de la liaison à des séquences d’ADN [172]. Le motif basique des sous-unités HIF reconnait spécifiquement le motif HBS, dont les caractéristiques furent abordées à la section 1.4.1.2. Chaque sous-unité est requise pour la liaison des hétérodimères HIF à l’ADN, puisque les sous-unités HIF-α se lient préférentiellement à l’extrémité 5’ du HBS tandis que la sous-unité HIF-1β se lie à l’extrémité 3’ [96].
Adjacent au domaine bHLH se trouve la région PAS (Per-Arnt-Sim, nommée à partir des protéines chez lesquelles ce domaine fut initialement identifié) (Figure 1.9) [173-175]. Les protéines HIF possèdent deux domaines PAS (PASA et PASB) qui contribuent à l’hétérodimérisation spécifique entre les sous-unités HIF-α et HIF-1β [176, 177].
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L’activité transcriptionnelle des sous-unités HIF-α est sous le contrôle de deux domaines de transactivation (TAD ; transactivation domain) : le domaine transactivateur NH2-terminal (N-TAD)
et le domaine transactivateur COOH-terminal (C-TAD) [178] (Figure 1.9). Ces deux domaines assurent ensemble une activité transcriptionnelle maximale. Néanmoins, le C-TAD semble promouvoir l’expression de gènes cibles communs aux différents facteurs HIF et constitue le site d’interaction des coactivateurs transcriptionnels CBP et p300 [179, 180]. Le N-TAD, quant à lui, chevauche le domaine ODD et serait responsable de la spécificité de gènes cibles des différentes sous- unités, via l’interaction avec différents cofacteurs [180]. Les acides aminés séparant les deux TAD correspondent à un domaine inhibiteur (ID ; inhibitory domain) qui semble impliqué dans l’inhibition des TAD en conditions oxygénées (Figure 1.9) [178].
La localisation nucléaire des sous-unités HIF-α est indépendante de leur dimérisation avec HIF-1β [181]. Elle dépend plutôt de séquences de localisation nucléaire (NLS) se trouvant aux extrémités C-terminale et N-terminale (Figure 1.9) [171]. Le transport nucléaire des HIF-α, de même que celui de HIF-1β, est dépendant de leur interaction avec les importines α et β [182, 183].
Figure 1.9: Les domaines fonctionnels des sous-unités HIF.
Les sous-unités HIF représentées : HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α pleine longueur et HIF-1β.
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HIF-1 et HIF-2
HIF-1α est la protéine prédominante de la réponse hypoxique et de loin la plus étudiée. Produit du gène HIF1A, elle fut découverte en 1991 suite à l’identification de séquences précises en 3’ du gène de l’EPO responsables de son expression en conditions hypoxiques [184]. La protéine HIF-1α fut identifiée en tant que facteur nucléaire induit en hypoxie présente au niveau de ces séquences [185]. Il fut ensuite démontré que HIF-1α agit en tant qu’hétérodimère avec la protéine HIF-1β [165, 186]. Depuis, HIF-1α et ses isoformes suscitent un grand intérêt en tant que facteurs régulant une multitude de processus cellulaires et physiologiques. La sous-unité HIF-1α est considérée comme étant exprimée de manière constitutive dans tous les types cellulaires et représente l’isoforme prédominante dans la majorité de ceux-ci [187, 188]. Conséquemment, HIF-1 est responsable de l’expression de la plupart des gènes induits en réponse à l’hypoxie.
La sous-unité HIF-2α a été découverte en 1997 par différents groupes et initialement identifiée en tant que EPAS1 (endothelial PAS domain protein-1 ; protéine endothéliale à domaine PAS 1), MOP2 (member of PAS superfamily 2 ; membre de la superfamille PAS 2) ou HRF (HIF- related factor ; facteur semblable à HIF) [189-192]. HIF-2α est le produit du gène HIF2A et est considérée comme très similaire à HIF-1α dans sa régulation par l’hypoxie, sa capacité d’hétérodimérisation, ses domaines fonctionnels et sa capacité de liaison à l’ADN. Ceci découle du haut degré d’homologie entre les deux protéines. HIF-2α possède 48 % d’homologie de séquence avec HIF-1α et un haut niveau de conservation dans ses domaines fonctionnels [189]. En effet, une homologie de séquence d’environ 85 % est observée entre les domaines bHLH de HIF-1α et HIF-2α et d’environ 70 % entre leurs domaines PAS et C-TAD. Les acides aminés entourant les sites de modifications dépendants de l’O2 ont aussi une similarité de 70 %. Finalement, le mécanisme de
transport nucléaire dépendent d’un NLS est conservé chez HIF-2α [182]. 1.5.2.1 Les différences fonctionnelles entre HIF-1 et HIF-2
En dépit du haut degré de similarité existant entre HIF-1α et HIF-2α, des distinctions notables furent mises en évidence [193]. Ces distinctions sont soulignées par des études d’inactivation génique chez la souris qui ont permis d’associer des phénotypes et processus différents à chaque sous-unité. Ainsi, la délétion de HIF-1α provoque des défauts embryonnaires létaux au niveau cardiaque et vasculaire, tandis que la délétion de HIF-2α, également létale, est plutôt associée à une bradycardie et des défauts vasculaires et pulmonaires [194].
Premièrement, bien que le facteur HIF-2 régule plusieurs gènes cibles communs avec HIF-1, il en possède plusieurs qui lui sont uniques. Notamment, il est accepté que HIF-2 n’est pas impliquée dans l’expression d’enzymes du métabolisme glycolytique [195]. Toutefois, la production d’EPO est
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sous le contrôle spécifique de HIF-2 [47]. Les gènes OCT4 (produisant un facteur de transcription crucial au maintien des cellules souches) et DMT1 (divalent metal transporter 1 ; le transporteur principal du fer dans l’intestin) sont d’autres exemples de gènes cibles spécifiques à HIF-2 [196, 197]. Comme précédemment dit, cette spécificité serait principalement conférée par le domaine de transactivation N-TAD de HIF-2α, qui ne démontre qu’environ 40 % de similarité avec celui de HIF- 1α [180]. Il semblerait que des cofacteurs uniques, interagissant entre autres avec le N-TAD, soient médiateurs de cette spécificité [193]. En effet, une distribution différentielle envers certains sites peut être observée entre HIF-1 et HIF-2 à l’échelle du génome, mais celle-ci ne semble pas dépendre des séquences distinctes d’ADN [98]. En dépit de ces différences, il y a néanmoins un haut degré de chevauchement dans les sites de liaison de HIF-1 et HIF-2 à l’échelle du génome [97]. Paradoxalement, HIF-2 ne semble toutefois contribuer que de manière très faible à la réponse transcriptionnelle dans le contexte d’étude (1 % d’O2 pendant 16h), soulignant encore une fois des
différences fonctionnelles.
Deuxièmement, des différences sont retrouvées dans l’expression relative de HIF-1α et HIF- 2α au sein des différents types cellulaires. Globalement, HIF-2α présente une expression plus restreinte que HIF-1α, mais serait particulièrement élevée dans les tissus impliqués dans le transport systémique de l’O2 (poumons, cœur, endothélium, reins) [188, 198]. Des inductions protéiques
différentes de HIF-1α et HIF-2α en réponse à l’hypoxie sont également observées au sein d’organes particuliers. Par exemple, bien que dans les hépatocytes, cardiomyocytes et cellules endothéliales du myocarde les deux sous-unités soient induites en hypoxie, elles sont induites dans des populations de cellules différentes dans les reins et le cerveau [199, 200]. HIF-2α semble aussi plus fortement induite au niveau des poumons que HIF-1α. Ainsi, les distinctions entre les réponses induites par HIF-1 et HIF-2 dépendent, entre autres, des patrons d’expression et d’induction spatiotemporels respectifs de leurs sous-unités HIF-α.
Finalement, HIF-1α et HIF-2α présentent différentes sensibilités face à une diminution des niveaux d’O2. Dans certains types cellulaires, une stabilisation de HIF-2α peut être observée à des
concentrations d’O2 relativement plus élevées que HIF-1α [188, 201]. De plus, en réponse à des
conditions hypoxiques prolongées, les niveaux de HIF-2α sont plus persistants que ceux de HIF-1α, qui sont graduellement réduits après leur induction initiale [202, 203]. Il fut proposé que HIF-1 serait particulièrement responsable de la réponse initiale au stress hypoxique (< 24 h) alors que HIF-2 serait impliquée de la réponse à de l’hypoxie chronique (> 24 h) [204]. Un médiateur crucial de ce changement d’isoforme est le facteur HAF (hypoxia-associated factor ; facteur associé à l’hypoxie), qui, suite à une exposition prolongée en hypoxie, entraine la dégradation sélective de HIF-1α et promeut l’activation de HIF-2α (Figure 1.10) [205].
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Figure 1.10: Les niveaux et l’implication respectives de HIF-1 et HIF-2 dans la réponse hypoxique.
HIF-1 est impliquée de façon majeure dans la réponse initiale à l’hypoxie. Un changement dans les niveaux d’isoformes HIF-1α et HIF-2α, médié par le facteur HAF, favorise l’activité de HIF-2 pour la réponse au stress hypoxique prolongé. Les niveaux de HAF sont eux-mêmes modulés en fonction de la durée d’hypoxie. (Schéma inspiré de Koh et al., 2012 [204]).
En somme, ces évidences soulignent l’implication complémentaire et non redondante de HIF- 1 et HIF-2 dans la réponse au stress hypoxique. Ainsi, plusieurs mécanismes convergent afin de permettre une réponse hypoxique précise selon l’intensité et la durée du stress, en fonction du contexte cellulaire et de la sous-unité HIF-α impliquée.
HIF-3
Le dernier membre de la famille des HIF à avoir été identifié est la protéine HIF-3α, qui possède des caractéristiques assez particulières, mais dont beaucoup reste encore à découvrir [206]. HIF-3α a été identifiée pour la première fois en 1998 chez la souris, où son interaction avec HIF-1β et les séquences HRE fut démontrée [207]. L’existence de plusieurs variants d’épissage de HIF-3α (10 transcrits furent identifiés chez l’humain à ce jour) a par la suite été mis en évidence, rendant difficile l’élucidation du rôle de l’hétérodimère HIF-3 dans la réponse à l’hypoxie [206, 208]. Chacun des variants HIF-3α interagit avec HIF-1β, HIF-1α et HIF-2α [209]. Plusieurs d’entre eux possèdent le domaine ODD et sont donc régulés par les niveaux d’O2 de manière similaire aux autres sous-
unités α [208-210]. L’expression de certains variants HIF-3α serait en effet augmentée en réponse à l’hypoxie [211-213]. Une des caractéristiques des protéines HIF-3α est que, contrairement à HIF-1α et HIF-2α, aucune ne possède de domaine de transactivation C-terminal (C-TAD) (Figure 1.9). La majorité possède plutôt un domaine LZIP (leucine zipper) unique dont le rôle n’a pas encore été caractérisé.
La protéine HIF-3α pleine longueur (HIF-3α1 chez l’humain), ainsi que certains des variants longs (HIF-3α2/7/8/9 chez l’humain), possèdent le N-TAD et le domaine ODD (Figure 1.9). Il fut proposé que les longs variants HIF-3α agissent principalement en tant qu’activateurs
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transcriptionnels, mais que certains d’entre eux pourraient avoir des rôles versatiles et dépendants du contexte cellulaire [207, 209, 210, 212, 214-216]. Ceux-ci semblent néanmoins avoir des activités relativement plus faibles que HIF-1α et HIF-2α.
Jusqu’à récemment, il était généralement accepté que HIF-3α ait un rôle négatif sur la réponse transcriptionnelle à l’hypoxie, via une inhibition de l’activité de HIF-1α et HIF-2α. Ceci demeure vrai pour le variant humain HIF-3α4, dépourvu de tout domaine de transactivation et du domaine ODD. Ce variant, via son interaction avec HIF-1α, HIF-2α, de même qu’avec HIF-1β, agit alors en tant que dominant négatif en inhibant leur liaison aux séquences HRE [217, 218].
Les différentes protéines HIF-3α semblent donc jouer des rôles différents, et parfois opposés, sur l’expression génique en hypoxie. Il est maintenant évident que HIF-3α peut être un médiateur positif de la réponse transcriptionnelle au stress hypoxique, au même titre que HIF-1α et HIF-2α. Des analyses d’expression à grande échelle chez des embryons de zebrafish soulignent que HIF-3 aurait des activités communes avec HIF-1 dans la régulation de certains processus, mais également des fonctions et gènes cibles distincts [210]. HIF-3α est également exprimée dans la plupart des tissus, quoique plus faiblement que HIF-1α [212]. Toutefois, l’expression respective des variants est différente selon les tissus et peut être différemment régulée au cours du développement et dans des cellules cancéreuses. Ceci amène un défi supplémentaire pour la compréhension du rôle et de la contribution de chaque variant dans la réponse hypoxique.
HIF-1β
La sous-unité HIF-1β est aussi connue sous le nom d’ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator). Elle fut découverte en 199 en tant que partenaire du facteur AhR (aryl hydrocarbon receptor), requis pour sa translocation au noyau et son activité dans la réponse aux xénobiotiques (molécules étrangères et toxiques, ex : pesticides, médicaments) [175]. La sous- unité HIF-1β ne possède pas les domaines de transactivation conservés entre les protéines HIF-α. Elle ne semble toutefois pas dépourvue d’activité transcriptionnelle. En effet, HIF-1β possède un domaine de transactivation à son extrémité C-terminale, nécessaire à la complémentation de l’activité de son partenaire AhR (Figure 1.9) [219]. En revanche, ce domaine de transactivation ne semble pas essentiel dans le contexte de la réponse transcriptionnelle à l’hypoxie [186]. La dimérisation des HIF- α avec HIF-1β est toutefois requise pour la formation d’un complexe actif liant l’ADN, puisque la combinaison de leurs motifs basiques respectifs est nécessaire pour la reconnaissance des séquences consensus HBS.
Il semblerait que la sous-unité HIF-1β soit constitutivement exprimée et hautement stable [165, 167, 220]. Elle est effectivement dépourvue du domaine ODD responsable de la courte demi-
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vie des sous-unités HIF-α. Le consensus apparent sur sa stabilité est par contre mis en doute par plusieurs évidences indiquant que la régulation de HIF-1β serait beaucoup plus complexe que généralement décrite [221]. Ainsi, dès les premières études sur la régulation de HIF-1α par l’oxygène, il fut observé que l’expression d’HIF-1β était aussi induite en conditions d’hypoxie [165, 166]. Néanmoins, il fut montré que cette régulation ne survenait pas dans tous les types cellulaires [181]. Brièvement, il semblerait qu’en réponse à l’hypoxie, différents mécanismes d’induction de HIF-1β peuvent survenir dans certains types cellulaires, soit au niveau de son expression, soit directement au niveau protéique [166, 181, 222-225]. Ceci souligne la possibilité de mécanismes de régulation communs avec les sous-unités HIF-α. HIF-1α serait même un régulateur direct de l’expression de HIF-1β dans certains types cellulaires, potentiellement afin d’assurer des niveaux non limitants de son partenaire [224, 225]. L’hétérodimérisation des HIF-α avec HIF-1β permettrait aussi de stabiliser ce dernier au noyau [225].
1.5.4.1 Les différentes sous-unités HIF-β
Il existe en réalité d’autres isoformes de HIF-1β: ARNT2, ARNT3 (aussi nommée ARNTL (ARNT-like protein), MOP3 (member of PAS protein 3) ou BMAL1 (brain and muscle ARNT-like 1) et ARNTL2 (aussi nommée MOP9). HIF-1β est le partenaire principal des sous-unités HIF-α, mais il a démontré que les HIF-α peuvent aussi former des hétérodimères fonctionnels avec ARNT2, ARNT3 et ARTNL2 [226-229].
La sous-unité ARNT2, découverte en 1996 chez la souris, possède une homologie de séquence de 57 % avec HIF-1β [230]. Leurs régions basiques respectives sont presque identiques et leurs domaines HLH et PAS ont une homologie de séquence de 80 %. Contrairement à l’expression ubiquitaire de HIF-1β, ARNT2 n’est fortement détectée qu’au niveau du système nerveux central et des reins, où son expression est même plus élevée que celle de HIF-1β [230-232]. Ceci souligne son importance et son rôle de médiateur de la réponse hypoxique au sein des cellules du cerveau, où elle forme des complexes fonctionnels avec HIF-1α [226]. Sa délétion dans des cellules neuronales est donc associée à une induction hypoxique de gènes cibles significativement réduite [233].
Des rôles principalement communs dans la réponse transcriptionnelle à l’hypoxie ont été conférés à HIF-1β et ARNT2. Il a en effet été démontré qu’elles ont une capacité comparable d’induction de reporteurs HRE et de gènes cibles [227]. Il a d’autant plus été montré qu’ARNT2, en complexe avec HIF-1α, est capable de restaurer la réponse transcriptionnelle hypoxique de cellules déplétées en HIF-1β [226]. L’inactivation génique de HIF-1β chez un modèle murin entraine une létalité embryonnaire reliée à des défauts vasculaires. Ces défauts phénotypiques sont moins sévères que lors d’une délétion d’HIF-1α [234] ce qui sous-entend l’implication ou une compensation par ARNT2 dans la régulation de gènes hypoxiques essentiels au développement [235-237]. La même
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chose peut être conclue lors d’une délétion sélective d’ARNT2 qui, de son côté, ne semble pas provoquer de problèmes de développement embryonnaire [233]. Finalement, une forte interaction génétique entre HIF-1β et ARNT2 a été mise en évidence, avec un arrêt développemental plus important lors de la délétion combinée de ces deux gènes [233]. Ces évidences sous-entendent une certaine redondance de ces isoformes, du moins dans la réponse au stress hypoxique au cours du développement, mais avec une plus grande dépendance envers l’activité de HIF-1β. De manière intéressante, il semblerait qu’un changement d’expression entre ces deux isoformes survienne au cours de développement et de la différenciation neurale, avec une diminution de HIF-1β et une augmentation de ARNT2 [238].
La protéine murine Arnt3, quant à elle, fut caractérisée en 1998, en raison de l’homologie élevée de son domaine PAS avec celui de HIF-1β [228]. Les domaines bHLH et PAS de la protéine Arnt3 présentent en fait 44 % et 42 % d’homologie avec ceux des protéines HIF-1β et Arnt2 murines, respectivement. Ainsi, ARNT3 a la capacité d’interagir avec les sous-unités HIF-1α et HIF-2α et de former des hétérodimères actifs aux séquences HRE [228, 239]. L’expression d’ARNT3 semble toutefois restreinte, son ARNm ayant seulement été détecté à de faibles niveaux au sein du cerveau et des muscles squelettiques, d’où son nom alternatif de BMAL1 (brain and muscle ARNT-like 1)