Extraction et qualité des fractions de MCAG

Hypothèse spécifique 1 :

La production de MCAG à partir de l’huile de lin fournit un mélange de MCAG avec cycles de 5 et de 6 carbones et le processus de production a un impact sur la qualité des fractions.

Objectif spécifique 1 :

Caractériser la fraction de MCAG produite à partir de l’huile de lin et évaluer ses effets sur la consommation et la prise de poids chez le rat.

Les MCAG sont principalement produits à partir des acides linoléique et a- linolénique, mais ils peuvent également être générés à partir de l'acide oléique (Christie & Dobson, 2000). Les MCAG générés à partir de l'acide linoléique sont majoritairement constitués d'isomères cyclopentyles (cycles à 5 atomes de carbone, C5), tandis que ceux générés à partir de l'acide a- linolénique sont un mélange d'isomères C5 et cyclohexyle (cycles à 6 atomes de carbone, C6), en proportions presque égales. Les MCAG formés à partir de l'acide oléique sont des acides gras cycliques saturés.

Une première question s’est posée. Devions-nous produire des MCAG endogènes ou exogènes ? Comme l'huile de canola utilisée dans notre étude était riche en acide oléique (61,3%) et contenait quelques pourcentages d'acides linoléique (17,8%) et a-linolénique (8%), la composition de la fraction MCAG dérivée du chauffage de cette huile aurait des cycles saturés et probablement plus d'isomères C5 de MCAG. Une fraction MCAG préparée

à partir de l’huile de soya (20,5% d'acide oléique, 52% d'acide linoléique et 6,7% d'acide a-linolénique) aurait certainement une teneur plus élevée en isomères C5 de MCAG, quelques acides gras cycliques saturés et des isomères C6 de MCAG. Pris ensemble, ces considérations indiquent que la fraction de MCAG préparée à partir de l'huile de canola serait principalement constituée de MCAG saturés et que celle préparée à partir de l’huile de soya serait pour la plupart des isomères C5 de MCAG. Ainsi donc, si des MCAG générés de manière endogène étaient isolés à partir de l’huile de canola ou de soya et supplémentés aux diètes, leurs effets sur les marqueurs de stress oxydant, l’inflammation et les profils lipidiques auraient pu être différents. En effet, il a été observé que l’huile de tournesol chauffée (riche en acide linoléique) et l'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique génèrent deux fois plus d'isomères C5 de MCAG que des isomères C6 (Romero et al., 2006). Ainsi, la fraction de MCAG générée de manière endogène à partir de l’une de nos deux huiles aurait entraîné une modification de l'équilibre entre les isomères C5 et C6 de MCAG, en faveur des premiers. On sait que les acides gras C5 tendent plus à s’accumuler dans les tissus que les acides gras C6 (Ribot et al., 1992). En outre, la plupart de ces acides gras C5 ou C6 générés de manière endogène seraient des acides gras saturés et on a constaté qu'ils étaient associés à des niveaux élevés de marqueurs du stress oxydatif (Tomey et al., 2007). En nous basant sur leur structure et leur incorporation préférentielle dans les tissus, nous pouvons supposer que la fraction de MCAG générée de manière endogène à partir de l’huile de canola ou de soya aurait induit des niveaux de stress plus élevés que ceux générés par le traitement thermique de l’huile de lin (qui contient des isomères C5 et C6 en proportion quasi égale). Cependant, dans la présente étude, nous voulions vérifier les effets d’une fraction de MCAG avec des isomères C5 et C6 dans des proportions à peu près égales. Nous avons donc contrôlé leur production à partir de l’huile de lin, une huile riche en acide α-linolénique.

Par conséquent, pour vérifier la première hypothèse spécifique énoncée ci- dessus, un protocole a été mis en place pour l’extraction des MCAG (Fig. 6.1). Ce protocole se résume globalement en une combinaison de la chromatographie sur colonne d’acide silicique et du fractionnement à l’urée comme décrit précédemment (Sébédio et al., 1987).

Après identification et quantification de différents isomères de MCAG, ces derniers ont été purifiés par un triple processus. D’abord, les fractions de MCAG ont été passées par une pompe à vide afin de les débarrasser des traces de solvants organiques. Ensuite, elles ont été passées dans une solution de Na2SO3 afin d’éliminer de possibles peroxydes. Enfin, nos

fractions ont été filtrées avec 2% de bentonite pour les débarrasser d’impuretés. Avant d’être incorporées aux diètes, les MCAG ont été saponifiés afin d’obtenir des acides gras libres.

Figure 6.1. Schéma d’extraction des monomères cycliques d’acides gras à partir de l’huile de lin chauffée.

En accord avec la littérature (Rojo & Perkins, 1987; Sebedio et al., 1987), nos fractions de MCAG issues de l’huile de lin chauffées contenaient des structures à cycles à 5 carbones (45%) et des structures à cycles à 6 carbones (41%) comme illustré au chapitre 4 de cette thèse (Fig. 4.1 et Tab. 4.2), 3% d’acide linoléique et 11% de divers acides gras.

Huile de lin fraîche

Mise en ampoules sous courant de N2

Ampoules d’huile scellées sous N2

Chauffage à 275 °C pendant 12h

Huile chauffée

Saponification

Acides gras libres

Estérification

Méthyles esters d’acides gras, MEAG

Chromatographie sur colonne d’acide silicique

Fraction non polaire Fraction polaire

Fraction libre Fraction avec l’urée

Fractionnement à l’urée

H2O + HCl 3%

Extraction à l’hexane H2O + HCl 3%

Extraction à l’hexane

MEAG à chaîne linéaire Monomères cycliques d’acides gras, MCAG

Synthèse d’esters picoliniques

Esters picoliniques de MCAG

GC GC-MS

Identification d’isomères de MCAG Quantification des MCAG

Tableau 6.1. Comparaison de deux méthodes de production des MCAG, du protocole expérimental et les effets des MCAG sur la consommation et le gain de poids chez le rat.

Présente étude Desmarais et al. ₍₂₀₁₅₎

Méthode de production des MCAG Huile de lin chauffée, 275 °C, 12h, chromatographie et fractionnement à l’urée. Synthèse chimique multi-étapes

Méthode de purification des fractions de MCAG Neutralisation des peroxydes (Na2SO3), filtrage avec du bentonite et pompe à vide Chromatographie sur couche mince suivie des méthodes

analytiques dont la spectrométrie de masse Pureté des fractions de

MCAG 86% >90%

Forme des MCAG

administrés aux rats Acides gras libres Acides gras libres Proportion des MCAG dans

la diète

0,5% des lipides

totaux 0,5% des lipides totaux Durée de l’expérimentation 28 jours 3 jours

Modèle animal Rat Wistar Rat Sprague-Dawley

Jours d’adaptation aux diètes purifiées

7 0

Effet des MCAG sur la consommation

Effet des MCAG sur le gain de poids

MCAG : monomères cycliques d’acides gras,

Contrairement à Desmarais et collaborateurs qui avaient observé une baisse de consommation et de gain de poids chez les rats nourris avec les MCAG après trois jours d’expérimentation (Desmarais et al., 2015), nous n’avons observé aucune différence significative entre les groupes de rats

(Tableau 6.1). D’une part, l’utilisation des MCAG synthétiques produits par une synthèse chimique multi-étapes dans l’étude de Desmarais (avec une pureté de 90%) et, d’autre part, la triple purification de nos fractions de MCAG et l’ajout d’une semaine d’adaptation aux diètes purifiées dans notre étude pourraient expliquer ces différences. En particulier, concernant la purification des fractions, nous avions d’abord neutralisé les peroxydes éventuels avec le Na2SO3 ; ensuite nous avions filtré les fractions avec 2%

de bentonite afin d’éliminer d’éventuelles impuretés et enfin, nos fractions avaient été passées à la pompe à vide afin d’éliminer des traces de solvant. Nos résultats suggèrent que le soin mis dans la production des MCAG peut jouer un rôle crucial dans l’évaluation des effets des MCAG, confirmant ainsi notre première l’hypothèse spécifique. Il reste que, dans cette étude, il n’a pas été possible d’associer un type d’isomères de MCAG à des effets spécifiques.