Expression de Nrp-1 dans les précurseurs thymiques et les lymphocytes T

Après réarrangement de la chaîne β du TCR, la signalisation du pré-TCR dans les précurseurs thymiques immatures au stade de développement DN3 est nécessaire à la survie et à la prolifération des thymocytes au cours du processus appelé β-sélection [1]. La prolifération des thymocytes est requise pour effectuer le réarrangement de la chaîne α du TCR et exprimer un TCR de surface complet et fonctionnel. La prolifération des thymocytes cesse donc au stade DP tardif, avant le processus de sélection positive.

J’ai voulu savoir si l’activation et la prolifération des thymocytes induite par la signalisation du pré-TCR s’accompagnait de l’expression de Nrp-1. L’étude des thymocytes de souris par cytométrie de flux a permis de définir les grandes étapes du développement des lymphocytes Tαβ et d’analyser l’expression de Nrp-1 dans chacun de ces intermédiaires (Figure 33). L’expression de Nrp-1 est nulle ou faible aux stades DN1 et DN2, puis elle augmente progressivement aux stades DN3, DN4 et ISP. Les thymocytes DP les moins avancés dans la sélection thymique (DP1) expriment encore fortement Nrp-1, mais les thymocytes DP en cours de sélection positive (DP2 et DP3) et les thymocytes matures SP CD4+ et CD8+ n’expriment pas ou peu Nrp-1. Conformément aux données de la littérature, les lymphocytes Treg thymiques (SP TCRβ+ _CD4+ _CD25+_{) expriment fortement Nrp-1,}

104 résultats montrent donc une corrélation forte entre l’expression de Nrp-1 et la prolifération des thymocytes induite par la signalisation du pré-TCR.

Figure 33. Expression de Nrp-1 au cours du développement thymique

Les thymocytes de souris C57BL/6 âgée de 6 semaines ont été préparés et marqués simultanément avec des anticorps dirigés contre CD4, CD8, CD25, CD44, TCRβ, CD69 et Nrp-1 (ou son isotype contrôle) afin d’analyser l’expression de Nrp-1 dans les différents stades de développement des thymocytes. (A) Stratégie de caractérisation des différents stades de développement des thymocytes murins par leur phénotype de surface. (B) Schéma rappelant la séquence de différenciation des thymocytes, du premier stade DN1 aux stades les plus matures. (C) Expression de Nrp-1 dans chaque stade défini en (A). Cette analyse est représentative de trois expériences réalisées indépendamment.

105 Pour associer plus clairement l’expression de Nrp-1 à la prolifération des thymocytes, j’ai analysé l’expression de Nrp-1 dans les thymocytes en prolifération, repérés grâce à l’incorporation rapide de BrdU. Ces expériences ont révélé que les thymocytes en prolifération (BrdU+ FSChi) expriment en très grande majorité des niveaux élevés de Nrp-1 (Figure 34). Ces expériences suggèrent donc que l’expression de Nrp-1 dans les thymocytes murins est associée à la prolifération induite par la signalisation du pré-TCR.

Figure 34. Nrp-1 est exprimé fortement sur les thymocytes en prolifération in vivo

Des souris C57BL/6 âgées de 6 semaines ont été injectées avec 2 mg de BrdU dans 200 µl de PBS en i.p., ou uniquement 200 µl de PBS (contrôle). Une heure après, les animaux ont été sacrifiés et leurs thymocytes préparés pour l’analyse de l’expression de Nrp-1 en surface et de l’incorporation de BrdU dans l’ADN. On voit dans les deux diagrammes de gauche que les thymocytes ayant incorporé le BrdU dans leur ADN dans l’heure précédent le sacrifice sont blastiques (FSChi). La superposition d’histogrammes à droite compare l’expression de Nrp-1 dans les thymocytes BrdU- (gris clair) et dans les thymocytes BrdU+ (trait noir). Cette expérience a été réalisée deux fois sur plusieurs animaux avec des observations similaires.

Hormis les lymphocytes Treg CD25+, les lymphocytes T CD4+ et CD8+ matures naïfs n’expriment pas Nrp-1 à leur sortie du thymus (Figure 23). Dans les organes lymphoïdes périphériques, la population de lymphocytes T (TCRβ+_{) est hétérogène et contient des}

lymphocytes Treg (CD4+ Foxp3+), des lymphocytes T naïfs (CD4+ CD44lo et CD8+ CD44lo), et des lymphocytes T mémoire (CD4+ CD44hi et CD8+ CD44hi). J’ai analysé l’expression de Nrp- 1 dans ces différentes sous-catégories de lymphocytes T définies par leur phénotype de surface et leur expression de Foxp3 (Figure 35). Les lymphocytes Treg Foxp3+ expriment fortement et en grande majorité Nrp-1, alors que les lymphocytes T naïfs n’expriment pas Nrp-1. Une proportion non-négligeable de lymphocytes T CD4+ et CD8+ mémoire exprime Nrp-1 de manière indépendante de l’expression des marqueurs des lymphocytes Treg Foxp3 et CD25.

106

Figure 35. Expression de Nrp-1 sur les lymphocytes T matures en périphérie

Les splénocytes de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines ont été préparés et marqués par des anticorps dirigés contre TCRβ, CD4, CD8, CD44, CD25, Nrp-1 (ou son isotype contrôle) et Foxp3 (marquage intranucléaire). Les lymphocytes T (TCRβ+

) CD4+ et CD8+ ont alors été sous-divisés selon leur expression de CD44 et Foxp3 en CD4 naïfs (CD4+ CD44lo), CD4 mémoire (CD4+ CD44hi), Treg (Foxp3+), CD8 naïfs (CD8+ CD44lo) et CD8 mémoire (CD8+ CD44hi). La co- expression de CD25 et Nrp-1 dans chacune de ces sous-populations de lymphocytes T est montrée dans la deuxième rangée de diagrammes. Les seuils de positivité pour l’expression de CD25 et Nrp-1 ont été placés en fonction du marquage avec les isotypes contrôles respectifs (dernière rangée), et le pourcentage de cellules dans chaque cadrant est indiqué pour chaque sous-population (moyenne ± erreur type, n = 3 souris). Cette expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires.

Il existe une grande diversité dans les sous-types de lymphocytes T CD4+ et CD8+ mémoires, qui diffèrent notamment par les signaux nécessaires à leur homéostasie et par leur fréquence de renouvellement [19]. Il existe en particulier des sous-types de lymphocytes T mémoire dont la prolifération homéostatique est rapide et maintenue par l’activation de leur TCR par des complexes peptide/CMH [215-217]. L’analyse de l’expression du marqueur nucléaire associé à la prolifération Ki67 dans les lymphocytes T murins a révélé qu’environ 50% des lymphocytes T CD8+ Nrp-1+ et CD4+ CD25- Nrp-1+ sont Ki67+ (Figure 36). Ces données suggèrent donc que les lymphocytes T mémoires exprimant Nrp-1 sont en prolifération et pourraient correspondre aux sous-types de lymphocytes dépendant de contacts TCR – peptide/CMH pour leur homéostasie.

107

Figure 36. Expression de Nrp-1 et du marqueur de prolifération Ki67 sur les lymphocytes T matures en périphérie

Les splénocytes de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines ont été préparés et marqués par des anticorps dirigés contre CD3ε, CD4, CD8, CD25, Nrp-1 (ou son isotype contrôle) et le marqueur de prolifération Ki67 (marquage intranucléaire). (A) Les lymphocytes T (FSClo CD3ε+) ont été sous- divisés en CD8+, CD4+ CD25- et CD4+ CD25+, et (B) la co-expression de Ki67 et Nrp-1 a été analysée dans ces trois sous-populations de lymphocytes T. Les seuils de positivité pour l’expression de Ki67 et Nrp-1 ont été placés en fonction du marquage avec les isotypes contrôles respectifs (dernière rangée), et le pourcentage de cellules dans chaque cadrant est indiqué pour chaque sous-population (moyenne ± erreur type, n = 3 souris). Cette expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires.

L’ensemble de ces résultats obtenus sur les thymocytes et les lymphocytes T murins montre une corrélation nette entre la prolifération induite par l’activation du TCR et l’expression de Nrp-1 dans les lymphocytes T murins.