Etude fonctionnelle comparée des lymphocytes iNKT Nrp-1 + et iNKT Nrp-1

Les propriétés effectrices des lymphocytes iNKT reposent sur leur capacité à sécréter rapidement de grandes quantités de cytokines immuno-modulatrices après activation. Alors que les lymphocytes iNKT thymiques immatures (stades 1 et 2) produisent principalement IL- 4 et pas d’IFN-γ après activation, les lymphocytes iNKT matures (périphériques et thymiques de stade 3) sont capables de relarguer à la fois de grandes quantités d’IFN-γ et d’IL-4 après activation par α-GalCer [40]. En accord avec ces données, les lymphocytes iNKT Nrp-1+ activés in vitro par α-GalCer pendant 72 heures sécrètent 10 fois moins d’IFN-γ et 3 fois plus d’IL-4 que les lymphocytes iNKT Nrp-1- _{(Figure 26).}

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Figure 26. Sécrétion des cytokines IFN-γ et IL-4 par les lymphocytes iNKT Nrp-1-

et Nrp-1+ spléniques activés par α-GalCer in vitro

Des lymphocytes iNKT Nrp-1- et iNKT Nrp-1+ ont été triés par cytométrie de flux à partir de rates de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines. Ces cellules (2.104) ont ensuite été activées pendant 72 heures en présence de splénocytes irradiés (1.105, 30 Gy) et du ligand spécifique α-GalCer (100 ng/ml). Les surnageants de culture ont alors été récupérés et les concentrations en IFN-γ et en IL-4 dans ces surnageants ont été déterminées par cytométrie de flux grâce à l’utilisation d’un kit « Cytokine Bead Array » (CBA). Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes.

Bien que les lymphocytes iNKT soient reconnus pour leur capacité à produire simultanément l’IFN-γ et l’IL-4, il a été décrit, au sein de cette population de lymphocytes effecteurs, une grande diversité de sous-types aux profils de sécrétion de cytokines très variés [77]. Pour mieux appréhender la diversité des lymphocytes iNKT spléniques et des lymphocytes iNKT Nrp-1+ en particulier, j’ai analysé, par cytométrie de flux, la production simultanée d’IFN-γ, d’IL-4 et d’IL-13 par les lymphocytes iNKT spléniques 2H _{après une}

injection d’α-GalCer in vivo. Dans ces conditions, l’analyse indépendante de l’expression des trois cytokines révèle que la population de lymphocytes iNKT Nrp-1+ contient beaucoup moins de producteurs d’IFN-γ, d’IL-4 et d’IL-13 que les lymphocytes iNKT Nrp-1- (Figure

27A). Le défaut le plus marqué est observé pour la production d’IFN-γ par les lymphocytes

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Figure 27. Profil de production simultanée des cytokines IFN-γ, IL-4 et IL-13 par les lymphocytes iNKT Nrp-1- et Nrp-1+ spléniques activés par α-GalCer in vivo

Trente minutes après une injection de brefeldine A, des souris C57BL/6 de 8 semaines ont été injectées avec 2 µg α-GalCer dans 200 µl PBS, ou 200 µl de PBS seul. Les animaux ont été sacrifiés deux heures après l’injection d’α-GalCer et leurs splénocytes ont été préparés pour l’analyse du contenu intracellulaire en IFN-γ, IL-4 et IL-13 dans les lymphocytes iNKT Nrp-1-

et iNKT Nrp-1+. (A) Production d’IFN-γ (gauche), d’IL-4 (milieu), et d’IL-13 (droite) dans les lymphocytes iNKT non-stimulés (trait interrompu) et les lymphocytes iNKT Nrp-1- (gris) et iNKT Nrp- 1+ (noir) activés. (B) Stratégie d’analyse de la production simultanée d’IFN-γ, IL-4 et IL-13 dans les sous-populations de lymphocytes iNKT Nrp-1- et iNKT Nrp-1+. Les lymphocytes iNKT spléniques (CD19- CD1d Tet+) sont divisés en iNKT Nrp-1- et iNKT Nrp-1+. Chaque sous-type est alors divisé

98 en producteurs (IFN-γ+

) et non-producteurs (IFN-γ-

) d’IFN-γ, puis chaque sous-population résultante est analysée pour la co-expression d’IL-4 et d’IL-13. Les limites de détection des cellules positives pour l’expression des cytokines sont placées en fonction du marquage sur les lymphocytes iNKT de souris contrôles. Cette stratégie établit pour chaque sous-type de lymphocytes iNKT 8 sous-populations distinctes selon leur expression simultanée d’aucune, une, deux, ou trois des cytokines analysées. (C) Représentation en camembert de ces 8 sous- populations de producteurs de cytokines parmi les lymphocytes iNKT Nrp-1- (gauche) et iNKT Nrp- 1+ (droite). Les pourcentages de chaque sous-population (moyenne ± erreur type, n = 5 souris dans trois expériences indépendantes) ont été comparés entre les deux sous-types de lymphocytes iNKT grâce au test t de Student et la p-value résultante est indiquée (ns : non significatif, * : p<0,05, ** : p<0,01, *** : p<0,001).

L’intérêt de cette technique réside dans l’analyse de la production de plusieurs cytokines simultanément. J’ai donc utilisé une stratégie d’analyse qui permet de diviser les lymphocytes iNKT Nrp-1- et iNKT Nrp-1+ en 8 sous-populations effectrices selon leur expression combinée d’IFN-γ, d’IL-4 et d’IL-13 (Figure 27B). Conformément à ce qui est attendu de lymphocytes iNKT matures, cette méthode d’analyse a révélé que plus de 50% des lymphocytes iNKT Nrp-1- produisent à la fois IFN-γ, IL-4 et IL-13, et environ 20% produisent IFN-γ et IL-4, mais pas IL-13 (Figure 27C). Par contre, les lymphocytes iNKT Nrp-1+ ont un profil radicalement différent : moins de 20% d’entre eux produisent les trois cytokines simultanément, et presque 50% ne produisent ni IFN-γ, ni IL-4, ni IL-13 (Figure

27C). Le défaut de production de ces cytokines par les lymphocytes iNKT Nrp-1+ ne semble pas dû à un défaut général d’activation, puisque l’augmentation de l’expression de CD69 après activation par α-GalCer est rapidement observée aussi bien dans les lymphocytes iNKT Nrp-1- (Figure 28, rouge) que dans les lymphocytes iNKT Nrp-1+ (Figure 28, bleu).

Figure 28. Activation rapide des lymphocytes iNKT Nrp-1- et Nrp-1+ spléniques après injection d’α-GalCer

Des souris C57BL/6 de 8 semaines ont été injectées avec 2 µg α-GalCer dans 200 µl PBS, ou 200 µl de PBS seul. Les animaux ont été sacrifiés 1H30 et 3H après l’injection d’α-GalCer et leurs splénocytes ont été préparés pour l’analyse de l’expression de CD69 en surface des lymphocytes iNKT Nrp-1- (rouge) et iNKT Nrp-1+ (bleu). Ces résultats sont représentatifs de deux expériences réalisées indépendamment.

99 En résumé, les lymphocytes iNKT Nrp-1+, qui correspondent aux cellules récemment sorties du thymus, ont un défaut marqué de production d’IFN-γ après stimulation in vitro et in vivo, et, à la différence des lymphocytes iNKT matures Nrp-1-, sont majoritairement incapables de secréter rapidement et simultanément les cytokines IFN-γ, IL-4 et IL-13 après une activation in vivo.

4.1.5. Les lymphocytes iNKT producteurs d’IL-17 dans les organes lymphoïdes expriment