Expression in vivo des gènes des facteurs de virulence 1. Gènes de protéines de surface et de protéines flagellaires

temps précédents. Ce facteur sigma fait partie de la famille ECF (ExtraCytoplasmic Function) dont le rôle est de contrôler la réponse à des signaux environnementaux spécifiques.

Un autre gène régulateur agissant par quorum sensing (agr2, CDR3187) est exprimé tout au long des temps 6, 8, 14 et 38 h. Bien que ce gène ait été décrit comme spécifique aux souches 027 (R20291 et CD196) [254], celui-ci a été identifié dans d’autres souches de C. difficile (80 % des souches analysées) [315]. L’analyse de son expression par RT-PCR en temps réel montre une expression significative à 8, 14 et 38 h d’infection, suggérant le rôle de ce régulateur dans le processus de colonisation intestinale par la bactérie (tableau IX).

III.3.3. Expression in vivo des gènes des facteurs de virulence III.3.3.1. Gènes de protéines de surface et de protéines flagellaires

D’après les résultats des biopuces, aucun gène d’adhésine connu n’est différentiellement exprimé au cours des premières étapes de colonisation intestinale, du moins à partir de 4 h d’infection. Cependant l’évaluation par RT-PCR en temps réel de l’expression de trois gènes d’adhésines (fbpA, cwp84 et cwp66) montre des résultats différents (tableau IX, figure 46). Le gène fbpA serait exprimé de façon similaire à 4, 6, 8 et 14 h, puis son expression baisse de presque un facteur 2 à 38 h, ce qui suppose une plus forte expression aux premières heures d’infection. Le gène cwp66 est surexprimé pendant les temps 6, 8 et 14 h et le gène cwp84 est exprimé deux fois plus à 14 h. Ceci montre donc l’implication de ces protéines dans le processus de colonisation intestinale par la souche 027 R20291. Chez la souche 630, l’expression relative de ces trois gènes (fbpA, cwp66 et cwp84) est quasi constante à 8, 14 et 38 h [449], ce qui suggère l’établissement d’un processus de colonisation plutôt différent entre les deux souches. Plusieurs autres gènes de protéines de surface et de paroi semblent aussi être impliqués dans le système de colonisation de la souche 027 R20291. Parmi les protéines codées par ces gènes, il y aurait Cwp10 et Cwp25 deux paralogues de SlpA qui seraient respectivement surexprimées à partir de 38 h et de 8 h post-infection.

Cette différence de colonisation entre les deux souches a été également observée in vitro sur des cellules épithéliales humaines Caco-2 (figure 47), ainsi qu’au cours de la cinétique de colonisation de souris monoxéniques (figure 48). En comparaison à la souche 630∆erm, la

souche 027 R20291 est en effet capable de mieux adhérer aux cellules épithéliales in vitro et est également capable de mieux coloniser les fèces et les caeca de souris. Le suivi de la cinétique de colonisation in vivo montre que la souche 027 R20291 commence à coloniser le tractus gastro-intestinal assez rapidement tout comme la souche 630∆erm, puis le taux de colonisation reste constant à partir de 24 à 48 h d’infection. Ce taux de colonisation est toutefois plus important pour la souche 027 que pour la souche 630∆erm (différence de 4,48 x 108

bactéries/g de fèces) (figure 48). Cette différence n’a pas été cependant observée en essai de compétition entre les deux souches (figure 49).

Concernant les gènes flagellaires, très peu de gènes sont régulés pendant les temps d’analyse : les gènes flbD, motB et fliP sont régulés positivement en début du processus d’infection (à 4 h) alors que les gènes flhA, flhG et fliN le sont plus tardivement (à 38 h). Ni l’expression du gène fliD ni celle du gène fliC ne semblent varier au cours de ces temps d’étude.

III.3.3.2. Gènes des toxines

L'expression des gènes de toxines semble être assez précoce chez la souche R20291. A 6 h d'infection, on constate déjà une augmentation de l’expression des gènes des toxines TcdA et TcdB par rapport au taux d’expression à 4 h. Cela est également valable pour le gène tcdE. Le taux d’expression continue à augmenter jusqu’à un taux 3 à 4 fois plus supérieur à 38 h d’infection (figure 50). Les résultats de la transcriptomique de la souche 630 montrent par ailleurs une forte expression des gènes des toxines TcdA et TcdB ainsi que du régulateur positif TcdR à partir de 38 h d’infection [446]. Cela indique que les gènes de toxines sont exprimés plus tôt chez la souche 027 R20291 en comparaison à la souche 630.

Les gènes de la toxine binaire cdtA et cdtB sont également exprimés assez tôt chez la souche R20291 avec un maximum d’expression à 8 h et à 14 h. Ce taux d’expression est toutefois nettement plus inférieur à celui des gènes des toxines TcdA et TcdB (figure 50).

Jusqu'à ce jour, toutes les études réalisées sur les souches 027 se contredisent quant à la capacité de ces souches à produire plus de toxines par rapport aux autres souches moins virulentes. Alors que certains chercheurs confirment que les souches 027 sont capables de produire une plus grande quantité de toxines, d’autres montrent le contraire. Au terme de cette

Etude de la cinétique de colonisation in vivo  

étude, nous confirmons que la souche 027 R20291 présente une transcription rapide des gènes de toxines TcdA et TcdB suggérant une production de toxines précoce au cours du processus d’infection. Cette production précoce induirait alors une apparition rapide des symptômes de l’infection. De plus, les souches 027 sont capables de produire la toxine binaire qui semble aussi être produite assez rapidement. Cette toxine pourrait ainsi avoir un rôle important dans le processus de virulence des souches 027. Même si son rôle dans la pathogénicité divise encore la communauté scientifique, notre étude actuelle ainsi que la précédente (avec le mutant ∆FliC) suggèrent fortement son implication dans la virulence de C. difficile.

III.3.3.3. Gènes de la sporulation

De très nombreux gènes de sporulation sont fortement exprimés au cours de la cinétique de colonisation intestinale par la souche 027 R20291. Le processus de sporulation se déroule normalement en sept étapes depuis la forme végétative jusqu’à l’obtention de la spore mature (figure 51) [450]. In vivo au cours de nos expériences, les gènes impliqués dans les différentes étapes de formation de la spore sont exprimés à différents temps du processus d’infection de la souche 027. Une certaine logique temporelle se dégage d’ailleurs à partir des temps d’expression de ces gènes (figure 52). La reconstitution de leur cinétique d’expression permet de constater un début d’expression des gènes de sporulation 6 h après l’infection (correspondant au début d’expression de spo0A). Le processus de sporulation se poursuit jusqu’à 38 h après l’infection avec une forte expression des gènes des protéines de la paroi sporale à 14 h et 38 h (jusqu’à 75 fois plus qu’aux temps précédents).

Parallèlement, nous avons observé l’expression de quelques gènes de germination 8 h après l’infection. Cela correspond probablement au processus de germination des spores présentes dans l’inoculum de départ (88 spores/ml).

Le phénomène de sporulation de la souche 027 R20291 intervient donc assez rapidement au cours de l’infection de l’hôte. Ce résultat a été confirmé par la détermination de la cinétique de production de spores récoltées dans les fèces de souris. Cette cinétique montre l’obtention des premières spores à partir de 8 h d’infection (≈  104

spores / g fèces). Le taux de sporulation continue ensuite d’augmenter jusqu’à un niveau constant de 10⁶ - 10⁷ spores/ml à partir de 24 h

(figure 53.a). La détermination du nombre de spores pouvant adhérer aux caeca de souris après 7 jours d'infection par la souche 027 R20291 montre un taux d’adhésion de 8 x 10⁴ spores / g caeca contre un taux de 1.5 x 10⁵ bacilles / g caeca (figure 53. b). Ceci prouve donc que les spores peuvent adhérer aux cellules épithéliales tout autant que les bacilles. Grâce à cet essai et celui du mutant ∆FliC, nous avons montré, pour la première fois, la capacité des spores de C. difficile à adhérer aux cellules épithéliales in vivo. Jusque là, une seule équipe s’est penchée sur cette problématique et avait montré la capacité des spores de C. difficile à adhérer aux cellules en culture Caco-2 [451].

III.3.4. Expression in vivo de gènes spécifiques aux souches 027 et à la souche