Analyse transcriptomique in vitro du mutant ∆FliC complémenté

mutant ∆FliC, il est alors intéressant de l’étudier de plus près et d’essayer de comprendre son rôle et son mode de fonctionnement.

II.2.3.2. Analyse transcriptomique in vitro du mutant ∆FliC complémenté

La multitude de gènes touchés par la mutation de fliC souligne l’importance de la flagelline et des flagelles dans les processus de survie et de virulence de la bactérie. Afin de valider ces résultats, nous avons décidé d’analyser la souche complémentée de fliC, toujours en essai de transcriptomique. Cet essai ne pouvant pas être réalisé en modèle animal à cause de la difficulté au maintien du plasmide in vivo, il a été choisi de réaliser l’analyse in vitro avec la souche complémentée d’une part et les souches sauvage et mutante ∆FliC ayant intégré le même plasmide sans insert (le gène fliC) d’autre part. La souche complémentée a été obtenue par intégration du plasmide pMTL84151 contenant le gène fliC dans le mutant ∆FliC. La complémentation a été vérifiée à l’échelle génique par PCR et à l’échelle phénotypique par évaluation de la capacité de mobilité en milieu BHI 0,4 % agar. La cinétique de croissance des trois souches ∆FliC, 027 et ∆FliC complémentée a été également comparée afin de vérifier l’absence d'écarts de croissance significatifs pouvant influer sur les résultats de l’étude transcriptomique (figure 42).

L’analyse transcriptomique des ARNm des trois souches ∆FliC, 027 et ∆FliC complémentée montre le rétablissement total, dans la souche complémentée, de l’expression des gènes affectés suite à l’inactivation de fliC. Ces résultats nous permettent donc d’affirmer avec certitude que seule la mutation de fliC est à l’origine les variations d’expression retrouvées in vivo, suggérant ainsi l’implication directe ou indirecte de fliC dans plusieurs processus cellulaires dont la sporulation et la production de toxines.

En comparant les résultats de la transcriptomique in vitro des deux souches mutante

∆FliC et sauvage 027 R20291, nous avons constaté la variation de gènes tout à fait différents de

ceux variants in vivo. Globalement, 258 gènes sont différentiellement exprimés dans la souche mutante ∆FliC cultivée in vitro contre 310 dans le modèle animal. Parmi ces gènes, 123 sont surexprimés et 135 sont sous-exprimés. Seuls 26 gènes sont communs aux deux analyses in vivo et in vitro et trois d’entres eux sont exprimés inversement. Dans l’analyse in vitro, nous ne

retrouvons pas la majorité des gènes qui ont été jugés intéressants lors de la précédente analyse, à part quelques gènes de régulation, de transport membranaire et de sporulation. Aucun gène de mobilité, y compris fliD, n’est à priori affecté par la mutation de fliC in vitro. Aucun gène de toxine n’est non plus affecté par cette mutation. C. difficile se comporte donc différemment en milieu de culture (PY) et en modèle animal, renforçant l’idée de l’importance des études réalisées sur des modèles animaux afin d’améliorer la compréhension de la physiopathologie des processus infectieux.

II.2.4. Conclusion

La flagelline FliC semble jouer un rôle important dans le processus d’adhésion et de colonisation de C. difficile. Ce rôle est plus ou moins variable selon les souches et il paraît plus remarquable chez la souche hypervirulente 027. Mais pour cette souche, le rôle de la flagelline ne semble pas se restreindre au phénomène d'adhésion et de colonisation, il impliquerait également plusieurs autres processus cellulaires. Cela a été constaté suite à l’inactivation du gène

fliC dans la souche 027 R20291. Le mutant provoque en effet la mort de la majorité des souris

infectées, phénomène rarement obtenu dans ce type de modèle animal. Les souris qui ont succombé à l’infection par le mutant ont montré des signes d’ICD avec diarrhée et inflammation du caecum. Cela n’a cependant pas été observé chez le même mutant ∆FliC construit dans la souche 630∆erm, ce qui montre la spécificité de ce caractère chez la souche 027. L’analyse transcriptomique globale comparant l’ensemble des ARNm de la souche sauvage à ceux de la souche mutante a permis de montrer la dérégulation de plusieurs gènes. Au total, 310 gènes ont été différentiellement exprimés chez le mutant ∆FliC dont 179 sont surexprimés et 131 sont sous-exprimés. La plupart de ces gènes sont en rapport avec la sporulation, la colonisation, la production de toxines, la résistance aux antibiotiques, la régulation, le transport membranaire, mais aussi en liaison avec des mécanismes d’adaptation et de survie de la bactérie dans le tractus gastro-intestinal.

La mutation de fliC s’accompagne donc d’un changement d’expression de certains facteurs de virulence avec d’un côté la diminution de l’expression de facteurs de colonisation et d’un autre côté l’augmentation de l’expression des gènes de la toxine binaire, des gènes de sporulation et

Etude des protéines flagellaires  

de gènes de réponse aux stress (production du p-cresol, système toxine-antitoxine, système padR, système crispr...). La rupture du flagelle semble s’accompagner d’une répression des gènes d’adhésines comme les gènes de la protéine de liaison à la fibronectine fbpA, de la protéine de choc thermique groEL ou encore de la protéine cwp66. Cela a pour effet la diminution de la capacité d’adhésion du mutant qui a été d’ailleurs observée lors des essais in vivo. En contre partie, la souche mutante ∆FliC serait capable de produire plus de spores tant in vitro qu’in vivo et elle serait également capable de produire plus de toxine binaire (vu l’augmentation de l’expression des gènes cdtA et cdtB). Il est en revanche important de signaler que les gènes des deux toxines TcdA et TcdB sont réprimés chez le mutant ∆FliC. L’ensemble de ces résultats montre ainsi l’existence d’un lien entre la flagelline ou les flagelles de manière générale et les phénomènes de production de toxines, de sporulation et de réponse aux conditions de stress. Les flagelles seraient un facteur de virulence incontestable chez C. difficile. Les résultats récapitulatifs permettant la comparaison des effets de mutation des flagelles pour les deux souches 630∆erm et 027 R20291 sont résumés dans le tableau VIII.

Plusieurs gènes spécifiques aux souches 027 (R20291 et CD196) et d’autres spécifiques à la souche R20291 seule sont également affectés par la mutation de fliC. Ces gènes pourraient expliquer la particularité du rôle de la flagelline dans la souche 027 par rapport à celle de la souche 630∆erm.

Parmi les produits des gènes spécifiques aux souches 027, trois sont retrouvés dans le sécrétome de la bactérie. Leur hyperproduction pourrait donc être directement liée à la mort des souris. Or deux de ces gènes sont surexprimés chez le mutant ∆FliC : CDR2278 qui code une protéine putative d’adhésion/hydrolyse du peptidoglycane et CDR2492 qui code la sous-unité CDTb de la toxine binaire. Ce résultat impliquant la sous-unité CDTb souligne encore une fois l’importance de la toxine binaire dans la virulence de C. difficile même si cela n’a pas été clairement établi jusqu’ici.

Les gènes uniques à la souche 027 R20291 sont également d’une importance capitale car ils peuvent être tout aussi importants voire plus importants que les gènes spécifiques aux souches 027. Quatre de ces gènes uniques sont affectés par l’inactivation de fliC et ils sont tous surexprimés. Trois d’entre eux appartiennent au transposon conjugatif Tn6104 (CDR1759-60 et CDR1747) et le quatrième code une protéine non encore caractérisée. Ces gènes présentent donc

une piste intéressante qui pourrait expliquer le caractère virulent de la souche mutante ∆FliC de

C. difficile et dont l’exploration pourrait améliorer notre compréhension par rapport aux

fonctions de la flagelline.

Au vu des données obtenues par ces expériences de transcriptomique, le rôle des flagelles et de la flagelline semble être assez complexe impliquant probablement différents régulateurs et différents facteurs de virulence, du moins chez la souche 027 R20291.

Etude de la cinétique de colonisation in vivo